Clonagem Gênica 1-Introduçao 2- Estratégia geral de clonagem gênica 3-Clonagem gênica

1. Clonagem Gênica 1-Introduçao 2-Estratégia geral de clonagem gênica 3-Clonagem gênica 4-Vetores de clonagem plasmidial 5-Isolamento de gene por PCR Edmar Vaz de Andrade

2. Vetor + fragmento de DNA isolado 1-Introduçao Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos. DNA recombinante Multiplicação do DNA recombinante em uma célula hospedeira Isolamento e estudos para a caracterização do fragmento de DNA purificado (gene isolado)

3. 1-Introduçao Tecnologia do DNA recombinante (TDR): conjunto de técnicas que permite o isolamento de fragmentos gênicos. Relevância: possibilita o isolamento e multiplicação de genes in vitro para posterior análise/caracterização Duas importantes classes de enzimas: Endonucleases de restrição (Tipo II) DNA ligase

4. 2-Estratégia geral de clonagem gênica 1-isolamento de um fragmento de DNA 2-Inserção em um vetor de escolha (DNA recombinante ou quimera) 3-Transporte para o interior de uma célula hospedeira (transformação) 4-Seleçao de células transformantes (OGM) 5-Replicação da molécula de DNA recombinante 6-Multiplicação de células, cada uma contendo cópias do mesmo plasmídio recombinante (clones)

5. 3-Clonagem gênica Clivagem Extremidades coesivas Clivagem do DNA pela enzima de restrição EcoRI Extremidades Coesivas

6. 3-Clonagem gênica Fragmentos de DNA genômico Vetor de clonagem Extremidades complementares Extremidades incompatíveis (b e c) não se ligam ao vetor DNA recombinante Isolamento de fragmento gênico com enzimas de restrição tipo II Ligação de fragmentos isolados a um vetor de clonagem pela DNA ligase

7. Região de Múltiplos Sítios de Clonagem Vetor Plasmidial de Clonagem 4-Vetor de Clonagem Plasmidial Componentes básicos de vetor plasmidial de clonagem

8. 4-Vetor de Clonagem Plasmidial 1-Origem de replicação em E. coli (10 a 20 cópias do plasmídio por célula) 2-Genes que conferem resistência a antibióticos 3-Sítios únicos para diferentes endonucleases de restrição pBR322: plasmídio para clonagem em Escherichia coli (1977)

9. 5-Isolamento de gene por PCR Rev (HInd III) 5’ 3’ Gene de phuA 3’ 5’ DNA genômico de C. violaceum FW (BamH I) PCR Hind IIII A-3’ Gene de phuA 3’-A BamH I Amplificação do gene de phuA de Chromobacterium violaceum IniciadoresespecíficosparaChromobacteriumviolaceumATCC12472

10. 5-Isolamento de gene por PCR Clonagem do gene de phuA