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人 感 染 猪 链 球 菌 病 样品采集运送与实验室检测方案

浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术 培训会议. 人 感 染 猪 链 球 菌 病 样品采集运送与实验室检测方案. 丽水市 CDC 兰进权. 提纲. 病原学简介 样品采集与运送 实验室检测. 病原学简介. 分类 培养特性 生化特征 致病因子. 链球菌分类. 伯杰分类 6大类群，29个种 16 SrRNA 序列同源性和化学分类 链球菌属分类学定义 无芽孢革兰氏阳性细菌，细胞形态为球形或球杆状，直径0.5～2.0微米，细胞成对或成链排列，有些种具有荚膜。 ……. 链球菌分类. 根据溶血现象分类

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人 感 染 猪 链 球 菌 病 样品采集运送与实验室检测方案

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Presentation Transcript

  1. 浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术培训会议浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术培训会议 人 感 染 猪 链 球 菌 病样品采集运送与实验室检测方案 丽水市CDC 兰进权

  2. 提纲 • 病原学简介 • 样品采集与运送 • 实验室检测

  3. 病原学简介 分类 培养特性 生化特征 致病因子

  4. 链球菌分类 • 伯杰分类 • 6大类群，29个种 • 16SrRNA序列同源性和化学分类 • 链球菌属分类学定义 • 无芽孢革兰氏阳性细菌，细胞形态为球形或球杆状，直径0.5～2.0微米，细胞成对或成链排列，有些种具有荚膜。……

  5. 链球菌分类 • 根据溶血现象分类 • 甲型溶血性链球菌：称甲型溶血或溶血，溶血环中的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。 • 乙型溶血性链球菌：称乙型溶血或溶血，溶血环中的红细胞完全溶解，致病力强 • 丙型链球菌：无溶血环，一般不致病 • 猪链球菌α溶血(偶而也有弱β溶血或α溶血、β溶血现象均不明显 ) ，某些菌株在马血培养基上β溶血

  6. 链球菌分类 • 根据抗原结构的分类 • 兰氏分类：按多糖类抗原（C抗原）将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群) ，近年又增加U、V群，共20群，每个群有1个或多个种。 • 几乎所有群的菌株，都能从病猪体内分离得到，引起猪病并偶尔经伤口感染人的链球菌主要有 • R群的2型猪链球菌 • S群和D群的1型猪链球菌 • F群的咽峡炎链球菌 • L、S、T、U、V群链球菌等

  7. 链球菌分类 • 猪链球菌血清2型 • 兰氏分类：R群 • 根据菌体荚膜抗原特性不同，分为35个血清型：1/2，1～34型 • 致病性最强的是2型，其次为1型 • 2型猪链球菌 • 1954年英国分离 • 1968年命名为荚膜II型猪链球菌 • 分为致病力不同的株

  8. 猪链球菌培养特性 • 革兰氏阳性无芽胞球菌，兼性厌氧 • 营养要求较高，在普通培养基中生长不良，需补充血液、血清、葡萄糖等 • 在血清肉汤中易形成长链，管底呈絮状沉淀 • 在绵羊鲜血琼脂平板上37 ℃培养24小时，形成直径l～2毫米的细小菌落，灰白色，半透明，边缘整齐，凸起，光滑，α溶血（有时呈弱β溶血或溶血不明显），48小时后可有草绿色色素沉着。

  9. 猪链球菌培养特性 • 刚分离的猪链球菌，典型的革兰氏阳性链球菌，链长达二十多个 • 二代培养后细菌形态不典型，结晶紫作色不良，多为不成链球杆菌，少数呈短链状。

  10. 链球菌. Gram stain. CDC/Dr. Richard Facklam

  11. 链球菌

  12. 猪链球菌培养特性 • 10℃培养不生长，45℃培养生长，60℃30分钟试验不生长 • 55℃30分钟即可被杀死

  13. 猪链球菌生化特征 • 猪链球菌生化特性往往差异较大，一般难以作为分类依据 • 触酶试验阴性 • 水解七叶苷、淀粉和精氨酸，不水解马尿酸盐和明胶 • 分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖，不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇

  14. 致病因子 • 猪链球菌2型主要致病因子 • 溶菌酶释放蛋白（muramidase-released protein,MRP） • 细胞外因子（extracellular factor,EF） • 猪溶素（suilysin） • 荚膜多糖 • 用南通地区分离的人源猪链球菌对兔和小白鼠的攻击试验表明，猪链可使家兔发病，并引起死亡。而小白鼠不敏感

  15. 样品采集与运送 采样器材 样品种类 血液和脑脊液标本采集方法 样品运输保存 注意事项

  16. 采样器材 • 无菌封闭性好的试管，最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管，避免使用玻璃试管。 • 可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。 • 可以方便采集组织标本的无菌容器。 • 无菌的剪刀、镊子和手术刀。

  17. 采样器材 • 血平皿(或者血培养瓶)。 • 一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩等 • 带有冰袋或者冰排的安全可靠的保温运输容器 • 采样送检单

  18. 样品种类 • 现症病人不抗凝全血 • 现症病人抗凝血 • 发病4～7天、10～16天不抗凝血 • 脑脊液标本 • 尸体解剖应无菌采集肝、脾、心血、胸（腹）水 • 如有病死猪也可进行解剖，取肝、脾、肾、心血、肉

  19. 血液和脑脊液标本采集方法 • 无菌抽取血液5～10ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中 • 按常规方法腰穿采集适量脑脊液标本置于无菌试管中 • 采集标本的同时接种血平皿或者血培养瓶，置于35～37℃培养

  20. 样品运输保存 • 所有的原始标本在转运过程中应置于安全可靠容器中。 • 标本应冷藏运输。 • 需要马上检测的标本在实验室可暂放4-8℃冰箱。 • 剩余标本放置于-70℃保存。

  21. 注意事项 • 严格无菌操作，防止标本污染。 • 用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集。 • 应尽可能床边接种分离培养，如无法立即接种，应在样品送达实验室后立即进行分离。 • 在标本采集过程中，注意安全防护。使用一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩 • 采取预防措施，防止针头等锐器刺伤 • 如发生伤口意外暴露，应及时清洗和消毒，并预防性服药

  22. 实验室检测 猪链球菌检验程序 推片镜检 分离鉴定 检测要点

  23. 猪链球菌检验程序 病人检样（脑脊液、血液等） 增菌培养 （脑心肉汤/牛血清葡萄糖 肉汤/血培养瓶） 革兰氏染色 触酶试验 推片镜检

  24. 猪链球菌检验程序(续) 羊血琼脂平板 （37℃，5%CO2，24h） α溶血(偶而也有弱β溶血) PCR检测 血清学检测 生化鉴定

  25. 推片镜检 • 抗凝血或脑脊液可推片革兰氏染色镜检 • 阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒，偶尔可见革兰阳性球菌

  26. 感染鼠尾血推片

  27. 感染兔心脏血推片

  28. 分离鉴定 • 血平板直接接种 • 新鲜羊血琼脂平板/含8%新生牛血清的营养琼脂平板 • 血或脑脊液等标本 • 直接接种 • 组织标本 • 可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤，洗液接种平板 • 置37℃5% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时

  29. 分离鉴定 • 增菌培养 • 待检标本置约10倍体积脑心肉汤/含8%新生牛血清葡萄糖肉汤（附配方）/商品化血培养瓶中增菌培养37℃ 24小时 • 增菌培养物接种新鲜羊血琼脂平板，置37℃5% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时 • 如果是污染标本,则要接种于选择增菌培养液（含15微克/毫升多粘菌素B，30微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基）进行增菌

  30. 附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清） 成分： • 酵母浸膏 3克 • 10%葡萄糖溶液 20毫升 • 枸椽酸钠 3克 • 磷酸氢二钾 2克 • 牛肉汤 900毫升 • 24.7%硫酸镁 20毫升 • 0.5%对氨苯甲酸 5毫升 • 新生牛血清 80毫升

  31. 附：葡萄糖肉汤（含8%新生牛血清） 制法 • 除葡萄糖及硫酸镁外,其他各物混合,加热溶解,矫正pH至7.6,再煮沸5分钟 • 用滤纸过滤并分装于100毫升三角烧瓶内,每瓶50毫升,包扎瓶口,高压灭菌10磅20分钟 • 将葡萄糖配成10%水溶液,硫酸镁配成24.7%水溶液,分别高压灭菌8磅15分钟 • 每50毫升无菌肉汤内加入无菌葡萄糖及磷酸镁水溶液各1毫升,混匀.于37℃培养2天证明无细菌生长后存于冰箱内备用。

  32. 分离鉴定 • 形态学鉴定 • 挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检 • 筛检生化试验 • 猪链球菌触酶试验阴性，可与葡萄球菌区别 • 血清学检测 • 标准分型诊断血清，进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验 • 确定所分离的菌株为R群，与2型猪链球菌分型血清反应 • 目前国内无分型诊断血清供应。据报道,加拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。

  33. 分离鉴定 • 生化鉴定 • 血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验 • 符合链球菌特征，接种血平板纯培养后进行生化鉴定 • 梅里埃API生化鉴定系统API 20 strep可鉴定2型猪链球菌，推荐使用（鉴定程序详见操作说明）

  34. 分离鉴定 • PCR检测 • 猪链球菌种特异性基因16S rDNA • 猪链球菌2型和1/2型型特异的荚膜多糖基因cps2A • 毒力因子溶菌酶释放蛋白基因MRP • 细胞外蛋白因子基因EF

  35. 基因鉴定，使用PCR技术和对PCR产物进行序列分析检测猪链球菌种特异性16S rRNA。上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa

  36. 检测猪链球菌荚膜多糖基因（cps2A）上游引物：gttgagtccttatacacctgtt下游引物：cagaaaattcatattgtccacc检测猪链球菌荚膜多糖基因（cps2A）上游引物：gttgagtccttatacacctgtt下游引物：cagaaaattcatattgtccacc

  37. 检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段（mrp）上游引物：ggtatacctt gctggtaccg ttc下游引物：agtctctaca gctgtagctg g

  38. PCR反应的条件： 94℃预变性5分钟;94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，25个循环，最后延伸72℃、5分钟。取5微升扩增产物在1.2℅的琼脂糖凝胶中进行电泳。

  39. Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus suis Species and Serotypes 2 and 1/2 in Tonsils of Live and Dead Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2004, p. 3169–3175

  40. Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two Virulence-Associated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar Specimens from Pigs. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2002, p. 2922–2929 • The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 1999,p. 3146–3152

  41. Use of Ribotyping and Hemolysin Activity To Identify Highly Virulent Streptococcus suis Type 2 Isolates†. JOURNAL OF CLINICA MICROBIOLOGY, Jan. 1998, p. 15–19

  42. 检测要点 • 传代培养后细菌形态不典型,多为革兰氏阴性球杆菌,不成链,因此刚分离到的细菌形态观察十分重要 • 链球菌的生化特性变化较大，链球菌属内的各种链球菌的生化相近，因此，按照伯杰氏细菌鉴定手册难以对菌株进行菌种鉴定

  43. 检测要点 • 由于猪链球菌是新近发现的菌种，一些微生物自动鉴定系统没有该菌种的相关数据。98年用MAS-300微生物自动生化分析仪，曾将2型猪链球菌误判为血链球菌 • 用API 20 strep生化系统能很好地对分离株进行菌种鉴定 • PCR也是有效和快速的检测方法

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