浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术
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浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术 培训会议. 人 感 染 猪 链 球 菌 病 样品采集运送与实验室检测方案. 丽水市 CDC 兰进权. 提纲. 病原学简介 样品采集与运送 实验室检测. 病原学简介. 分类 培养特性 生化特征 致病因子. 链球菌分类. 伯杰分类 6大类群,29个种 16 SrRNA 序列同源性和化学分类 链球菌属分类学定义 无芽孢革兰氏阳性细菌,细胞形态为球形或球杆状,直径0.5~2.0微米,细胞成对或成链排列,有些种具有荚膜。 ……. 链球菌分类. 根据溶血现象分类

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人 感 染 猪 链 球 菌 病 样品采集运送与实验室检测方案

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Presentation Transcript


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浙江省丽水市人感染链球菌病疫情控制和诊疗技术培训会议

人 感 染 猪 链 球 菌 病样品采集运送与实验室检测方案

丽水市CDC

兰进权


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提纲

  • 病原学简介

  • 样品采集与运送

  • 实验室检测


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病原学简介

分类

培养特性

生化特征

致病因子


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链球菌分类

  • 伯杰分类

    • 6大类群,29个种

  • 16SrRNA序列同源性和化学分类

  • 链球菌属分类学定义

    • 无芽孢革兰氏阳性细菌,细胞形态为球形或球杆状,直径0.5~2.0微米,细胞成对或成链排列,有些种具有荚膜。……


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链球菌分类

  • 根据溶血现象分类

    • 甲型溶血性链球菌:称甲型溶血或溶血,溶血环中的红细胞并未完全溶解。多为条件致病菌。

    • 乙型溶血性链球菌:称乙型溶血或溶血,溶血环中的红细胞完全溶解,致病力强

    • 丙型链球菌:无溶血环,一般不致病

  • 猪链球菌α溶血(偶而也有弱β溶血或α溶血、β溶血现象均不明显 ) ,某些菌株在马血培养基上β溶血


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链球菌分类

  • 根据抗原结构的分类

    • 兰氏分类:按多糖类抗原(C抗原)将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S和T群(其中缺I、J群) ,近年又增加U、V群,共20群,每个群有1个或多个种。

  • 几乎所有群的菌株,都能从病猪体内分离得到,引起猪病并偶尔经伤口感染人的链球菌主要有

    • R群的2型猪链球菌

    • S群和D群的1型猪链球菌

    • F群的咽峡炎链球菌

    • L、S、T、U、V群链球菌等


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链球菌分类

  • 猪链球菌血清2型

    • 兰氏分类:R群

    • 根据菌体荚膜抗原特性不同,分为35个血清型:1/2,1~34型

    • 致病性最强的是2型,其次为1型

  • 2型猪链球菌

    • 1954年英国分离

    • 1968年命名为荚膜II型猪链球菌

    • 分为致病力不同的株


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猪链球菌培养特性

  • 革兰氏阳性无芽胞球菌,兼性厌氧

  • 营养要求较高,在普通培养基中生长不良,需补充血液、血清、葡萄糖等

  • 在血清肉汤中易形成长链,管底呈絮状沉淀

  • 在绵羊鲜血琼脂平板上37 ℃培养24小时,形成直径l~2毫米的细小菌落,灰白色,半透明,边缘整齐,凸起,光滑,α溶血(有时呈弱β溶血或溶血不明显),48小时后可有草绿色色素沉着。


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猪链球菌培养特性

  • 刚分离的猪链球菌,典型的革兰氏阳性链球菌,链长达二十多个

  • 二代培养后细菌形态不典型,结晶紫作色不良,多为不成链球杆菌,少数呈短链状。


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链球菌. Gram stain. CDC/Dr. Richard Facklam


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链球菌


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猪链球菌培养特性

  • 10℃培养不生长,45℃培养生长,60℃30分钟试验不生长

  • 55℃30分钟即可被杀死


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猪链球菌生化特征

  • 猪链球菌生化特性往往差异较大,一般难以作为分类依据

  • 触酶试验阴性

  • 水解七叶苷、淀粉和精氨酸,不水解马尿酸盐和明胶

  • 分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露糖,不分解阿拉伯糖、鼠李糖和甘露醇


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致病因子

  • 猪链球菌2型主要致病因子

    • 溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)

    • 细胞外因子(extracellular factor,EF)

    • 猪溶素(suilysin)

    • 荚膜多糖

  • 用南通地区分离的人源猪链球菌对兔和小白鼠的攻击试验表明,猪链可使家兔发病,并引起死亡。而小白鼠不敏感


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样品采集与运送

采样器材

样品种类

血液和脑脊液标本采集方法

样品运输保存

注意事项


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采样器材

  • 无菌封闭性好的试管,最好使用负压采血管或带螺口盖的塑料管,避免使用玻璃试管。

  • 可以清楚标记且标记不易脱落的记号笔。

  • 可以方便采集组织标本的无菌容器。

  • 无菌的剪刀、镊子和手术刀。


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采样器材

  • 血平皿(或者血培养瓶)。

  • 一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩等

  • 带有冰袋或者冰排的安全可靠的保温运输容器

  • 采样送检单


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样品种类

  • 现症病人不抗凝全血

  • 现症病人抗凝血

  • 发病4~7天、10~16天不抗凝血

  • 脑脊液标本

  • 尸体解剖应无菌采集肝、脾、心血、胸(腹)水

  • 如有病死猪也可进行解剖,取肝、脾、肾、心血、肉


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血液和脑脊液标本采集方法

  • 无菌抽取血液5~10ml分置于有抗凝剂和无抗凝剂的无菌试管或者负压采血管中

  • 按常规方法腰穿采集适量脑脊液标本置于无菌试管中

  • 采集标本的同时接种血平皿或者血培养瓶,置于35~37℃培养


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样品运输保存

  • 所有的原始标本在转运过程中应置于安全可靠容器中。

  • 标本应冷藏运输。

  • 需要马上检测的标本在实验室可暂放4-8℃冰箱。

  • 剩余标本放置于-70℃保存。


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注意事项

  • 严格无菌操作,防止标本污染。

  • 用于分离培养的标本应在抗菌治疗前采集。

  • 应尽可能床边接种分离培养,如无法立即接种,应在样品送达实验室后立即进行分离。

  • 在标本采集过程中,注意安全防护。使用一次性隔离服、乳胶手套、防护口罩

  • 采取预防措施,防止针头等锐器刺伤

  • 如发生伤口意外暴露,应及时清洗和消毒,并预防性服药


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实验室检测

猪链球菌检验程序

推片镜检

分离鉴定

检测要点


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猪链球菌检验程序

病人检样(脑脊液、血液等)

增菌培养

(脑心肉汤/牛血清葡萄糖

肉汤/血培养瓶)

革兰氏染色

触酶试验

推片镜检


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猪链球菌检验程序(续)

羊血琼脂平板

(37℃,5%CO2,24h)

α溶血(偶而也有弱β溶血)

PCR检测 血清学检测 生化鉴定


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推片镜检

  • 抗凝血或脑脊液可推片革兰氏染色镜检

  • 阳性标本可见中性粒细胞内吞噬颗粒,偶尔可见革兰阳性球菌


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感染鼠尾血推片


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感染兔心脏血推片


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分离鉴定

  • 血平板直接接种

    • 新鲜羊血琼脂平板/含8%新生牛血清的营养琼脂平板

    • 血或脑脊液等标本

      • 直接接种

    • 组织标本

      • 可直接涂抹平板或剪碎用无菌生理盐水洗涤,洗液接种平板

  • 置37℃5% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时


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分离鉴定

  • 增菌培养

    • 待检标本置约10倍体积脑心肉汤/含8%新生牛血清葡萄糖肉汤(附配方)/商品化血培养瓶中增菌培养37℃ 24小时

    • 增菌培养物接种新鲜羊血琼脂平板,置37℃5% CO2培养箱或者烛缸中培养24小时

    • 如果是污染标本,则要接种于选择增菌培养液(含15微克/毫升多粘菌素B,30微克/毫升萘啶酮酸的脑心培养基)进行增菌


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附:葡萄糖肉汤(含8%新生牛血清)

成分:

  • 酵母浸膏 3克

  • 10%葡萄糖溶液 20毫升

  • 枸椽酸钠 3克

  • 磷酸氢二钾 2克

  • 牛肉汤 900毫升

  • 24.7%硫酸镁 20毫升

  • 0.5%对氨苯甲酸 5毫升

  • 新生牛血清 80毫升


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附:葡萄糖肉汤(含8%新生牛血清)

制法

  • 除葡萄糖及硫酸镁外,其他各物混合,加热溶解,矫正pH至7.6,再煮沸5分钟

  • 用滤纸过滤并分装于100毫升三角烧瓶内,每瓶50毫升,包扎瓶口,高压灭菌10磅20分钟

  • 将葡萄糖配成10%水溶液,硫酸镁配成24.7%水溶液,分别高压灭菌8磅15分钟

  • 每50毫升无菌肉汤内加入无菌葡萄糖及磷酸镁水溶液各1毫升,混匀.于37℃培养2天证明无细菌生长后存于冰箱内备用。


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分离鉴定

  • 形态学鉴定

    • 挑取平板上可疑菌落革兰氏染色镜检

  • 筛检生化试验

    • 猪链球菌触酶试验阴性,可与葡萄球菌区别

  • 血清学检测

    • 标准分型诊断血清,进行乳胶凝集试验或玻片凝集试验

    • 确定所分离的菌株为R群,与2型猪链球菌分型血清反应

    • 目前国内无分型诊断血清供应。据报道,加拿大和澳大利亚有商品化血清分型试剂。


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分离鉴定

  • 生化鉴定

    • 血平板上挑选可疑菌落进行革兰氏染色和触酶试验

    • 符合链球菌特征,接种血平板纯培养后进行生化鉴定

    • 梅里埃API生化鉴定系统API 20 strep可鉴定2型猪链球菌,推荐使用(鉴定程序详见操作说明)


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分离鉴定

  • PCR检测

    • 猪链球菌种特异性基因16S rDNA

    • 猪链球菌2型和1/2型型特异的荚膜多糖基因cps2A

    • 毒力因子溶菌酶释放蛋白基因MRP

    • 细胞外蛋白因子基因EF


Pcr pcr 16 s rrna cagtatttaccgcatggtagatat gtaagataccgtcaagtgagaa

基因鉴定,使用PCR技术和对PCR产物进行序列分析检测猪链球菌种特异性16S rRNA。上游引物:cagtatttaccgcatggtagatat下游引物:gtaagataccgtcaagtgagaa


Cps2a gttgagtccttatacacctgtt cagaaaattcatattgtccacc

检测猪链球菌荚膜多糖基因(cps2A)上游引物:gttgagtccttatacacctgtt下游引物:cagaaaattcatattgtccacc


Mrp ggtatacctt gctggtaccg ttc agtctctaca gctgtagctg g

检测溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段(mrp)上游引物:ggtatacctt gctggtaccg ttc下游引物:agtctctaca gctgtagctg g


Pcr 94 5 94 30 60 30 72 30 25 72 5 5 1 2

PCR反应的条件: 94℃预变性5分钟;94℃、30秒,60℃、30秒,72℃、30秒,25个循环,最后延伸72℃、5分钟。取5微升扩增产物在1.2℅的琼脂糖凝胶中进行电泳。


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Multiplex PCR Assay for Detection of Streptococcus suis Species and Serotypes 2 and 1/2 in Tonsils of Live and Dead Pigs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2004, p. 3169–3175


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  • Multiplex PCR Assays for Simultaneous Detection of Six Major Serotypes and Two Virulence-Associated Phenotypes of Streptococcus suis in Tonsillar Specimens from Pigs. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2002, p. 2922–2929

  • The cps Genes of Streptococcus suis Serotypes 1, 2, and 9: Development of Rapid Serotype-Specific PCR Assays. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. 1999,p. 3146–3152


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Use of Ribotyping and Hemolysin Activity To Identify Highly Virulent Streptococcus suis Type 2 Isolates†. JOURNAL OF CLINICA MICROBIOLOGY, Jan. 1998, p. 15–19


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检测要点

  • 传代培养后细菌形态不典型,多为革兰氏阴性球杆菌,不成链,因此刚分离到的细菌形态观察十分重要

  • 链球菌的生化特性变化较大,链球菌属内的各种链球菌的生化相近,因此,按照伯杰氏细菌鉴定手册难以对菌株进行菌种鉴定


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检测要点

  • 由于猪链球菌是新近发现的菌种,一些微生物自动鉴定系统没有该菌种的相关数据。98年用MAS-300微生物自动生化分析仪,曾将2型猪链球菌误判为血链球菌

  • 用API 20 strep生化系统能很好地对分离株进行菌种鉴定

  • PCR也是有效和快速的检测方法


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谢谢!


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