质粒 DNA 的提取纯化与鉴定

质粒DNA的提取纯化与鉴定

一、基因克隆的质粒载体 1、定义双链闭环DNA； 1kb--200kb；独立存在于宿主染色体之外；具复制起始点；复制和转录不同程度依赖于宿主基因；编码某些酶，使宿主具有特殊标志，可供选择。

2、载体性质 （1）.复制能力；（2）.容纳外源DNA的能力；（3）.选择标记：抗生素耐受。（4）.引入多克隆位点；（5）.引入重组选择标记。

3、载体分类： 按功能分 1.克隆载体 2.表达载体按宿主性质 1.原核载体:质粒载体、粘粒、噬菌粒、 λ噬菌体、噬菌体M13等 2.真核载体:逆转录病毒、腺病毒、昆虫杆状病毒 3.穿梭载体

4、常用质粒载体 例如：1. pBR322、pUC 18/19、 pUC118/119、pGEM、 pBluescript、 pBluescript SK/KS等 2. pET、pGEMEX、pGEX等 3. pALTER等 5、常用质粒宿主： HB101、DH5α、TG1、JM系列等 BL21（DE3）等

二、质粒DNA的分离纯化 试剂的参考配方: • Solution I：50mmo1／L 葡萄糖、5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris•HCl(pH8.0)、1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0) • Solution II：0.4mo1／L Na0H，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合 • Solution III：5mo1／L 醋酸钾60 mL、冰乙酸11.5mL、水28.5mL • TE缓冲液：10mmo1／L Tris•HCl、1mmo1／L EDTA(pH8.0) （一）、细菌培养物的生长和收获将3mL含Amp的LB液体培养基加入到两支试管中，接入含重组质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

（二）、质粒DNA的提取 1．将过夜培养的2-4m1细菌，12,000rpm高速离心1分钟，彻底去除上清。(菌液较多时可以多次离心收集菌体)2．加入200  l solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。（注：Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。）3．加入250  l Solution II，立即轻柔上下颠倒离心管5-10次，使细菌裂解，室温放置(2-5分钟左右)至溶液变成澄清。（注：温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。） 4．加入350  l Solution III，立即轻柔上下颠倒5-10次至出现大量白色絮状沉淀，使之充分中和，室温放置2分钟。5．12,000rpm高速离心15分钟。

6．取出2ml样品收集管和吸附柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清小心吸取全部转移到吸附柱里。12,000rpm离心1分钟。7．取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将吸附柱放入同一支收集管中，吸取700  l Wash Solution到吸附柱，离心1分钟。8．重复步骤7一次。9．取下吸附柱，弃去掉收集管中的废液，将柱放入同—支收集管中，12,000rpm高速离心2分钟。10．将吸附柱放入干净的1．5m1的离心管中，在柱子膜中央加30-50  l TE或灭菌纯水，不要盖上离心管盖，室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温12,000rpm高速离心1分钟。注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。 11．取1-2 l洗脱液做浓度测定，1%琼脂糖凝胶电泳或酶切分析。

三、质粒DNA的鉴定 （一）、紫外光谱分析通常使用样品的吸光度鉴定其浓度和纯度。（二）、EB荧光分析（三）、电泳鉴定在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比关系。质粒DNA经单一酶切后与DNA Marker进行电泳对照，即可知该质粒的分子量大小。

质粒的电泳图谱

质粒DNA的鉴定和酶切分析 一、质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定二、质粒的限制性内切酶消化鉴定

实验原理 DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。

一般提取的质粒有3种构型： • 超螺旋的共价闭合环状 • 开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂 • 线状质粒DNA，即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂。 • 通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快， • 其次为线状DNA， • 最慢的为开环质粒DNA。

实验步骤1、制备1％琼脂糖凝胶：称取1 g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100mL 1×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀。2、胶板的制备 1）选择适当大小干净的有机玻璃内槽，放好样品梳子。 2）将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，加入3-5μl EB储存液（2mg/mL）摇匀，缓缓倒入有机玻璃制胶槽内，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。 3）待胶凝固后，小心地拔出梳子，将有机玻璃内槽放在电泳槽内。注意：DNA样品孔应朝向负电极一端。 4）加电泳缓冲液至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。3、加样用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品（5μl质粒+1μl 6× loading buffer)加入加样孔(记录点样顺序及点样量)。 4、电泳1）．接通电泳槽与电泳仪的电源。DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。2）．当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。

限制性内切酶 1. 定义：识别双链DNA分子核苷酸序列并加以切开 2. 来源：细菌的限制修饰系统 3. 特性：识别4 ~ 6个核苷酸序列产生平端和粘端 4. 应用：定点切割

酶切产生的末端 （1） ———G A T↓A T C——— ———C T A↑T A G———EcoRⅤ酶切产生平端 ———G A T PA T C——— ———C T AP T A G——— （2） ———G↓A A T T C——— ———C T T A A↑G———EcoRⅠ酶切产生5’突出粘端 ———G PA A T T C——— ———C T T A AP G——— (3） ———C T G C A↓G——— ———G↑A C G T C———PstⅠ酶切产生3’突出粘端 ———C T G C A PG——— ———GP A C G T C———

酶切反应 限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 20μl体积反应体系如下： A: 质粒（pGEM-T easy-NGF） 0.2-1 μg B: 10×酶切buffer 2.0μl C:限制性内切酶 EcoRⅠ 0.5μl D: 加ddH2O 至20μl 37℃水浴消化1小时。

质粒的酶切电泳 M1 1 2 3 M2

注意事项 • 购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。 • 尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。 • 通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。

质粒 DNA 的提取 纯化与鉴定