Evolução Molecular

1. Evolução Molecular O estudo da história dos organismos através das macromoléculas...

2. Ciências Históricas • Análise de documentos • Perda pela ação do tempo • Perda por acidentes ou ações criminosas • O historiador deve ser capaz de reunir a documentação disponível e tentar reconstruir um evento a partir dela • Novas evidências • Corroboram a história • Modificam a interpretação

3. Evolução • Alteração das freqüências gênicas

4. Inferências filogenéticas podem ser feitas através de: • Caracteres Morfológicos • Aspectos comportamentais • Fisiologia • Moléculas

5. Os organismos possuem padrões

6. E as moléculas também Alinhamento múltiplo de proteínas ribossomais L36

7. Moléculas • Não sofrem a ação do ambiente • A variação é considerada neutra • Mecanismos de modificação bem conhecidos pela genética molecular • Replicação do DNA • Mutações • Mecanismos de reparo

8. Alguns conceitos básicos...

9. Árvores...

10. Árvores Filogenéticas OTU – Unidade Taxonômica Operacional (Nó terminal) A F B G Ramo Terminal I C H Nó ancestral D Ramo Ancestral E

11. Árvores Filogenéticas A A 2 F B 3 B 1 G C 2 2 I C 2 H D 1 6 D E E 1 unidade Tempo

12. Árvores Filogenéticas

13. Relógio Molecular • À medida que duas espécies divergem de um ancestral comum, acumulam mutações em uma taxa regular, ficando progressivamente mais diferentes uma da outra...

14. Especiação 1 mutação 2 mutações 2 mutações 1 mutação 3 mutações 2 mutações Relógio Molecular A A1 A2 Acúmulo de Diferenças

15. Homologia • Um caráter é homólogo em dois organismos se foi herdado por ambos a partir de seu ancestral comum. • Para análise de sequências: • Não existe percentagem de homologia: ou uma seqüência é homóloga, ou não é • Quanto maior a similaridade entre as seqüências, maior a probabilidade de serem homólogas • No entanto, duas seqüências podem ser homólogas e não apresentar similaridades (depende do tempo de divergência entre elas)

16. Homologia Exemplos: Órgãos homólogos – asas de morcego e mãos de humanos (mesma origem) Órgãos similares – asas de morcego e asas de borboleta (mesma função)

17. HOMOLOGIA vs SIMILARIDADE Estes conceitos tendem a ser extremamente confundidos quando aplicados a sequências de DNA e proteínas Aplicações comuns: ‘high homology’, ‘significant homology’, ‘35% homology’. O termo homologia se refere a uma descendência evolucionária comum, enquanto similaridade se refere a uma medida quantitativa daquilo que há em comum.

18. Definições Críticas Concluir que duas (ou mais) sequências são homólogas é uma suposição/hipótese Só é possível se pudermos explorar diretamente os ancestrais comuns e todas as suas formas intermediárias Homologia entre dois genes  Similaridade entre eles (variável observável que pode ser expressa numericamente e correlacionada com probabilidade)

19. Especiação Duplicação do gene Homólogos: Ortólogos e Parálogos Importante !!! Distinguir entre dois tipos de relação entre homólogos, as quais diferem em suas implicações evolutivas e funcionais. Ortólogos:genes presentes em diferentes organismos que se originaram de um ancestral comum antes da especiação Parálogos: genes presentes em um mesmo organismo (geralmente famílias multigênicas) que evoluíram dentro de um mesmo genoma (antes ou depois da especiação)

20. Duplicação Gênica • Aumento da quantidade de genes nas células • Freqüente formação de pseudo-genes • (genes que foram desligados)

21. Finalmente... Filogenia Molecular

22. Vantagens e Desvantagens • Vantagens: • A comparação entre organismos muito diferentes é possível • Uso de genes diferentes para diferentes problemas • A evolução molecular é melhor compreendida que a morfológica • Existem modelos e testes • Relógio molecular e Neutralismo - Teoricamente é possível datar os eventos de divergência.

23. Vantagens e Desvantagens • Desvantagens: • Técnicas mais caras • Uso de produtos cancerígenos e radioativos • Árvores de genes e não de espécies

24. Escolha do Gene • De acordo com a taxa de substituições nucleotídicas, levando em conta o tempo estimado de divergência dos organismos a serem comparados • Pseudogenes, regiões intergênicas e íntrons são indicados para espécies próximas ou populações • Histonas são indicadas para filogenias entre reinos.

25. Métodos Moleculares • Extração do DNA total do organismo • Reação de PCR com “primers” apropriados para amplificar o gene escolhido • Purificação dos fragmentos • Seqüenciamento

26. Métodos Moleculares • Verificação da qualidade dos cromatogramas

27. Análise das Seqüências • BLAST (ferramenta do NCBI) • Permite a comparação rápida da seqüência obtida no laboratório com as seqüências presentes nos bancos de dados • Permite a busca por seqüências semelhantes para a construção de filogenias

28. A A A A A A G A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T T G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G G N Análise das Seqüências • Alinhamento de bases • Garante que os sítios a serem comparados tenham maior probabilidade de serem homólogos • http://www.megasoftware.net

31. Métodos de Reconstrução da Filogenia • Métodos que buscam, dentre todas as árvores possíveis, a que melhor represente a história evolutiva dos organismos estudados: • Máxima Parcimônia • Escolha da topologia que apresentar o menor número de substituições. • Máxima Verossimilhança • Escolha da topologia que apresentar o maior grau de adequação a um modelo de substituição. • Evolução Mínima • Escolha da topologia que apresentar o menor tamanho dos ramos • Problema: O número de topologias aumenta exponencialmente com o número de OTUs.

32. N. de árvores enraizadas N. de árvores não enraizadas N. de OTUs 2 1 1 3 3 1 4 15 3 5 105 15 6 945 105 7 10.395 945 8 135.135 1.395 9 2.027.025 135.135 10 34.459.425 2.027.025 15 2,13458 x 1014 7,90585 x 1012 20 8,20079 x 1021 2,21643 x 1020 25 1,19257 x 1030 2,53738 x 1028 30 4,9518 x 1038 8,68736 x 1036 40 1,00985 x 1057 1,31149 x 1055 50 2,75292 x 10762,83806 x 1074

33. CARACTERÍSTICAS DE UMA ÁRVORE FILOGENÉTICA A maioria das árvores apresenta um padrão mais complexo  necessidade de outros termos Seqs. monofiléticas: derivam de um ancestral comum Clade: grupo de seq. monofiléticas Grupo parafilético: quando algumas seqs. da clade são excluídas Grupo Polifilético: seqs. derivadas de diferentes ancstrais Árvore Inferida ≠ Árvore Real

34. Alinhamento de Sequências Diferenças entre sequências são pontuadas Se forem homólogas  ancestral comum = base para o estudo Os métodos utilizados SEMPRE produzem uma árvore, mesmo com informações errôneas Os nucleotídeos homólogos devem ser comparados

35. Conversão do alinhamento em uma árvore Diversos métodos MATRIZ DE DISTÂNCIAS Tabela contendo as distâncias evolucionárias entre todos os pares de sequências. Distância evolucionária: n diferença de nucleotídeos = comprimento do ramo comprimento das sequências

36. Conversão do alinhamento em uma árvore NEIGHBOR-JOINING - Usa os dados da matriz de distâncias - Inicialmente, assume que há só um nó interno e todos os ramos que levam às seqs. de DNA se irradiam dele. - Um par de seqs. é escolhido ao acaso, removido do nó e anexado a um novo nó - O comprimento do ramo é calculado - Este processo é repetido com todos os possíveis pares até a identificação do ramo com o menor comprimento - As sequências restantes passam pelos mesmos passos descritos acima até que o ramo com o segundo menor comprimento seja identificado, e assim sussecivamente

37. Conversão do alinhamento em uma árvore MÁXIMA PARSIMÔNIA Usa os dados de alinhamento mútiplo Parsimônia: é a preferência pela explicação mais simples para uma observação Estratégia que analisa diferentes árvores, identificando aquela que apresenta a menor via evolucionária = aquela que requer o menor número de mudanças de nucleotídeos para ir da seq. ancestral até as mais recentes Árvores são construídas ao acaso e o número de mudanças nucleotídicas é calculado até todas as possíveis topologias terem sido examinadas.

38. Avaliação da acurácia da árvore reconstruída ANÁLISE BOOTSTRAP Construção de um novo alinhamentoao acaso: O novo alinhamento compreende sequências que são diferentes do verdadeiro Mas tem um padrão similar de variabilidade Deve ser obtida a mesma árvore!