Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 34

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF PowerPoint PPT Presentation


  • 264 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF. Kazimierz Dąbrowski Katedra Chemii i Technologii Polimerów Wydział Chemiczny PW. Warszawa, 16.04.2012. Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas. Podstawowe definicje. Najczęściej stosowane skróty.

Download Presentation

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Spektrometria mas maldi tof tof

Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

Kazimierz Dąbrowski

Katedra Chemii i Technologii Polimerów

Wydział Chemiczny PW

Warszawa, 16.04.2012


Spektrometria mas maldi tof tof

Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas


Spektrometria mas maldi tof tof

Podstawowe definicje


Spektrometria mas maldi tof tof

Najczęściej stosowane skróty

EI (ElectronImpact) - jonizacja elektronamiMALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycąESI (ElectrosprayIonization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznymHPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa)MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowaTOF  (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotuPSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonówm/z - stosunek wartości masy do liczby ładunkówDIOS (Desorption/Ionization on PorousSilicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemieICP  (InductivelyCoupledPlasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie


Spektrometria mas maldi tof tof

Idea działania spektrometru mas

  • źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji,

  • analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku.

  • detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.


Spektrometria mas maldi tof tof

Jonizacja próbki


Spektrometria mas maldi tof tof

Jonizacja próbki cd.


Spektrometria mas maldi tof tof

Jonizacja próbki – lasery używane w technice MALDI

Nitrogen laser:

pro: well structured energy profile

contra: slow (maximum 50Hz)

Nd:YAG laser:

pro: fast (up to 1000Hz)

contra: Gaussian energy profile (non-structured)

Smartbeam/Smartbeam II

(modified Nd:YAG laser):

pro: fast (up to 1000Hz)

pro: well structured energy profile

A. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)


Spektrometria mas maldi tof tof

Matryce

Procesy zachodzące pod wpływem impulsu laserowego

Absorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy.

Odparowanie próbki na głębokość 2-3 li wyrzucenie strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni.

Dysocjacja termiczna matrycy.

Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+).

Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą. Możliwe drogi:

- dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion

- oderwanie elektronu

- oderwanie bądź przyłączenie protonu

- przyłączenie kationu bądź anionu


Spektrometria mas maldi tof tof

Matryce

  • Pożądanymi cechami matrycy MALDI są:

  • dość niska masa cząsteczkowa, co sprzyja łatwemu odparowaniu, ale wystarczająco duża, by odparowanie nie nastąpiło przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania próbki;

  • rozpuszczalność w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem;

  • kwasowość, by ułatwić protonowanie cząsteczek analitu;

  • obecność grup polarnych (hydrofilowych) w cząsteczce, co umożliwia rozpuszczanie matrycy w roztworach wodnych;

  • stabilność w warunkach wysokiej próżni;

  • wspomaganie jonizacji analitu;

  • zdolność intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymóg ten spełnia związek, posiadający układ sprzężonych wiązań podwójnych C=C (dlatego często matrycami są pochodne aromatycznych kwasów karboksylowych, często nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).


Spektrometria mas maldi tof tof

Matryce

Sinapicacid

Kwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowy

SINA

proteiny

Gentisicacid

Kwas 2-5-dihroksy benzoesowy

DHB

peptydy

2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoicacid

Kwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowy

HABA

Peptydy, polimery

Dithranol

1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-on

DIT

polimery

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid

Kwas α-Cyano-4-hroksy cynamonowy

CHCA, α-CHCA

Peptydy, lipidy

2,4,6-Trihydroxyacetophenone

2,4,6-trihroksy acetofenon

THAP

oligonukleotydy


Spektrometria mas maldi tof tof

Tryb liniowy


Spektrometria mas maldi tof tof

Tryb liniowy

  • Jak zwiększyć rozdzielczość?

  • Pulsedionextraction – polepszenie ogniskowania jonów

  • Optymalizacja przygotowania próbki – homogenizacja

  • Użycie reflektronu


Spektrometria mas maldi tof tof

Optymalne przygotowanie próbki


Spektrometria mas maldi tof tof

Najczęściej stosowane metody nanoszenia próbki (analitu i matrycy) to:

Metoda wysychającej kropli (drieddropletmethod) – jednowarstwowa:Przyrządza się osobno roztwór próbki i roztwór matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub – jeśli to niemożliwe – w dwóch kompatybilnych; niekiedy jeszcze używa się trzeciego roztworu - środka kationizującego, np. soli metalu (możliwe są różne rozpuszczalniki i stężenie). Wszystkie roztwory miesza się, a uzyskaną mieszaninę (0,5÷1 μl) umieszcza na płytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wadą tej metody jest powolne wysychanie próbki, co może prowadzić do rozdzielenia kryształów matrycy próbki i soli kationizującej.Modyfikacjami tej metody są: zastosowanie odparowywania próżniowego lub odparowywanie w strumieniu ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje się drobniejsze kryształy, lepszą rozdzielczość i powtarzalność oraz intensywność sygnałów.

Metoda cienkiej warstwy (thin-layermethod) – dwuwarstwowa:Roztwór matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA – roztwór nasycony w acetonie) nanosi się na płytkę MALDI i pozwala mu się wyschnąć, otrzymując cienką warstwę matrycy. Następnie 1 μl roztworu analitu nanosi się na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy.

Nanoszenie przez rozpylanie. Wariantami tej metody są: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez elektrosprej (electrospraysampledepositon).

Metoda mieszania ciał stałych (solid/solidsamplepreparation):Metoda polega na bardzo dokładnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i próbki (bez rozpuszczalnika) i prasowaniu całości w pastylkę. Stosuje się ją dla niektórych poliamidów, nierozpuszczalnych w pospolitych rozpuszczalnikach organicznych


Spektrometria mas maldi tof tof

Epot = zeUEkin = 1/2mv2

zeU = 1/2mv2v = (2zeU/m)1/2

t = L×(1/2eU)1/2×(m/z)1/2


Spektrometria mas maldi tof tof

Tryb reflektronu


Spektrometria mas maldi tof tof

Tryb reflektronu


Spektrometria mas maldi tof tof

Profil izotopowy


Spektrometria mas maldi tof tof

Profil izotopowy

C41H69N13O14S

[M+H]+: 1000.4880

[M+H]+: 1001.1409

C112H164N29O34S2

[M+H]+: 2524.1510

[M+H]+: 2525.8196

C253H363N55O75S

[M+H]+: 5404.6075

[M+H]+: 5407.9984

Masa monoizotopowa

Masa średnia


Spektrometria mas maldi tof tof

Kalibracja

tof= tdelay+ tacc + tdrift

F = E q = M a

d = a/2 tacc2

E = U/d q = z e

tacc = d √(2m/Uze)

tdrift= L √(m/2zeU)

tof=tdelay + d √(2m/Uze) + L √(m/2zeU)

tof=tdelay + (d √(2/Ue)+L √(1/2Ue)) × √(m/z)

t = C0+C1√(m/z)


Spektrometria mas maldi tof tof

MALDI–ToF/ToF

Ionpath in TOF1 region (linear TOF)

Ionpath in TOF2 region (reflectorTOF)

Ion source1 = MALDI ionsource

Ion source2 = LIFT re-accelerationcell

PCIS = Timediongate

PLMS = Post LIFT meta stablesuppressor


Spektrometria mas maldi tof tof

MALDI–ToF/ToF


Spektrometria mas maldi tof tof

MALDI–ToFw badaniach polimerów

  • Za pomocą MALDI można wyznaczyć następujące parametry polimerów:

  • Mn, Mw, PD

  • grupy końcowe polimeru

  • budowę kopolimeru

Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447


Spektrometria mas maldi tof tof

C

B

A

A9B2C

A10B2C

A8B2C

A9BC

A9B3C

A10BC

A8B3C

A11BC

A7B3C

A8B4C

A7B4C

A6B4C

A10C

A11C

A11C


Spektrometria mas maldi tof tof

Polimery polarne: poliwęglany, politlenki olefin

Polikwasy, poliestry, polimery słabo polarne (np. polistyren) 

Polisacharydy, teflon, poliolefiny

mass discriminationeffect


Spektrometria mas maldi tof tof

MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes, methylenechloride, THF, and chloroform

Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.


Spektrometria mas maldi tof tof

Wskazówkidla PT Klientów

  • Badane mogą być związki stałe, ewentualnie ciecze nielotne (ciśnienie w komorze pomiarowej < 10-7Torr).

  • Do pomiaru używamy zazwyczaj 5 mg substancji. Próbki można dostarczać albo już odważone (proszę podać masę próbki), lub w większych pojemnikach.

  • W razie tzw. wyższej konieczności do pomiaru wystarczy: substancji typu biologicznego (np. peptydu) 0,1 - 10 pmol, polimeru 50 - 200 pmol.

  • Można również dostarczyć próbkę w postaci roztworu w dowolnym, ale koniecznie lotnym i niekorodującym rozpuszczalniku (prosimy o podanie stężenia roztworu !)

  • Możliwy jest pomiar próbki nierozpuszczalnej, ale wówczas musi być ona w postaci możliwie drobnego proszku. Należy jednak podkreślić, że wyniki takiego pomiaru będą znacznie gorszej jakości, niż próbek rozpuszczalnych.

  • Kategorycznie odmawiamy przyjmowania podejrzanych, dymiących cieczy zawierających stężone lotne kwasy (np. HCI, HNO3) oraz substancji korodujących typu POCI3, wolne aminy, fenole, merkaptany itd.

  • Aby proces tworzenia jonów przebiegał możliwie wydajnie, próbka powinna być jak najczystsza. W szczególności nie powinna zawierać:

    • nadmiaru soli nieorganicznych z grupy litowców i miedziowców,

    • detergentów !!!,

    • buforów, zwłaszcza fosforanowych,

    • substancji silnie alkalizujących (reagują z matrycą),

  • W przypadku polimerów, co do których zachodzi podejrzenie, że mogą zawierać frakcje znacznie różniące się masą cząsteczkową ( np. Mn = 1 500 i Mn = 30 000) niezbędne jest wstępne rozdzielenie próbki na frakcje.

  • Prosimy o podanie spodziewanej masy cząsteczkowej, bądź przynajmniej zakwalifikowanie próbki do jednego z następujących przedziałów: < 5000; 5000-20000; > 20000

  • Do badanej próbki (lub grupy próbek) prosimy dołączyć „Zlecenie wykonania badania MALDI-ToF” (druk dostępny na stronie: www.ch.pw.edu.pl/~maldi)


Spektrometria mas maldi tof tof

Polecana literatura

  • M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp; AnalyticalChemistry, 57, 2935-2939 (1985)

  • K. Tanaka, H. Waiki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida; RapidCommunications in Mass Spectrometry, 2, 151-153 (1988)

  • R. C. Beavis, B. Chait, K.G. Standing; RapidCommunications in Mass Spectrometry, 3, 233-237 (1989)

  • M. Karas, M. Glückmann, J. Schäfer; Journalof Mass Spectrometry, 35, 1-12, (2000)

  • R. Zenobi and R. Knochenmuss; Mass SpectrometryReviews, 17, 337-366 (1998)

  • G. Montaudo, M. S. Montaudo, and F. Samperi, “ MassSpectrometry of Polymers ”, ed. G. Montaudo and R. P.Lattimer, 2002 , CRC Press, Boca Raton, FL, 419.


Spektrometria mas maldi tof tof

Dziękuję za uwagę…


  • Login