第十五章
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第十五章 核酸的研究方法 - PowerPoint PPT Presentation


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第十五章 核酸的研究方法. 一、核酸的分离、提纯和定量测定. 二、核酸的超速离心. 三、核酸的凝胶电泳. 四、核酸的核苷酸序列测定. 五、 DNA 聚合酶链反应( PCR ). 六、 DNA 的化学合成. 楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国. 一、核酸的分离、纯化和定量测定. 尽可能保持其天然状态,防止降解和变性。 条件温和,防止过酸、过碱、剧烈搅拌。 抑制核酸酶。. (一) DNA 分离.

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第十五章 核酸的研究方法

一、核酸的分离、提纯和定量测定

二、核酸的超速离心

三、核酸的凝胶电泳

四、核酸的核苷酸序列测定

五、DNA聚合酶链反应(PCR)

六、DNA的化学合成

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


一、核酸的分离、纯化和定量测定

尽可能保持其天然状态,防止降解和变性。

条件温和,防止过酸、过碱、剧烈搅拌。

抑制核酸酶。

(一)DNA分离

真核DNA以核蛋白(DNP)形式存在,DNP溶于水或高盐溶液(1mol/L NaCl),但不溶于低盐溶液(0.14mol/L NaCl),据此,采用高盐提取,低盐沉淀,可将DNP与RNA核蛋白分开,提取出DNP。

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


DNP可用水饱和的酚抽提,去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。

水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。

(二)RNA的分离

RNase 的灭活:

玻璃器皿:140-200℃,8h

塑料器皿:0.1%DEPC,37,过夜

提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍

反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀,上清中即为RNA核蛋白(RNP)。盐酸胍、苯酚等去蛋白。

★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法

★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法

蛋白质:<1.33g/ml

DNA:1.71g/ml左右

RNA:>1.89g/ml

★mRNA的制备:

oligo(dT)纤维素(琼脂糖凝胶)亲合层析法

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


(三)核酸含量的测定方法

核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260 nm和280nm的光吸收比值,进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

①磷的测定RNA中含磷量为9.0%,DNA中含磷量为9.2%,因此每测得1g磷就相当于含有11g核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化,使其有机磷变成无机磷,然后与钼酸铵定磷试剂作用,生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内,蓝色的深浅和磷含量成正比,可在660nm比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量,从而求出核酸的含量。

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


核糖和脱氧核糖的测定

RNA中核糖的测定用苔黑酚(3,5-二羟甲苯)法,利用RNA与浓盐酸和3,5-二羟甲苯作用生成绿色物质,在670 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的RNA的含量。

DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法,利用DNA在酸性条件下(冰醋酸和少量浓硫酸)与二苯胺作用生成蓝色化合物,在595 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的DNA的含量。

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样品在260 nm和280 nm的光吸收值(A值),从A260/A280的比值可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8,纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚,A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品,只要读出260mm的A值即可算出含量。通常以1A值相当于50μg/mL双螺旋DNA或40μg/mL单链DNA(或RNA)或20μg/mL寡核苷酸计算。这个方法既快速,又准确,而且不会浪费样品。

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


二、核酸的超速离心

不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),密度和沉降速率不同,用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来

这一方法常用于质粒DNA的纯化。

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


(一)核酸密度的测定

8M CsCl,45000rpm,16h

密度梯度:1.80g/ml(底部)~1.55g/ml(顶部)

平衡时:浮力密度=CsCl密度=离心力

ρ=ρ0 +4.2ω2(r2 - r02) × 10-10

ρ :浮力密度

ω :角速度(弧度/秒)

r:样品到转轴的距离

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


(二)测定DNA的G-C含量

G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系

ρ=0.100xG-C + 1.658

xG-C = ( ρ-1.658)× 10

但含5-甲基胞嘧啶多的DNA,其实际浮力密度会降低,低于理论值。

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


超螺旋DNA或

(三)溶液中核酸构象的研究

浮力密度:

RNA>DNA

变性DNA>双链DNA >蛋白质,

变性程度越大,浮力密度越大


三、核酸的凝胶电泳

(一)琼脂糖电泳

用于大片段DNA的分离,精度低,但分离范围广。

影响迁移率的因素:

①核酸分子的大小,迁移率与分子量的对数成反比②凝胶浓度③DNA的构象,超螺旋最快,线形其次,环形最慢④电流,不大于5V/cm

染色:0.5μg/ml EB(溴化乙锭)

RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定

琼脂糖电泳还可以用于DNA的制备与纯化

(二)PAGE电泳

用于小片段DNA的分析,精度非常高

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


四、核酸的核苷酸序列测定

(一)双脱氧终止法

英国 Sanger

1955 确定牛胰岛素结构, 1958 获诺贝尔化学奖

1975 设计出DNA测序法, 1980 获诺贝尔化学奖

合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国



双脱氧核苷酸测序法(MOV)

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


DNA序列分析仪:

四色荧光基团标记的dNTP


(二)化学裂解法Maxam-Gilbert,1977

原理:

利用特异性的化学裂解法,制备出长度只差一个核苷酸的片段群,然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。

32P-GCTACGTA:

在A处:32P-GCT和32P-GCTACGT

在G处: 32p ,32p-GCTAC

在C处:32P-G和32P-GCTA

在T处:32P-GC和32P-GCTACG

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


G反应:硫酸二甲酯

G+A反应:甲酸/哌啶

C反应:肼/NaCl/哌啶

C+T:肼/哌啶

哌啶:促使修饰化碱基脱落,并使脱碱基的磷酸二酯键断裂

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


32P *ACTTCGACAG

硫酸二甲酯(G):

*ACTTCG

*ACTTCGACAG

甲酸(G+A):

*A

*ACTTCG

*ACTTCGA

*ACTTCGACA

*ACTTCGACAG

肼/Nacl(C):

*AC

*ACTTC

*ACTTCGA C

*ACTTCGACAG

肼(C+T):

*AC

*ACT

*ACTT

*ACTTC

*ACTTCGAC

*ACTTCGACAG

从下往上读:CTACGTA,末端G不能读出。


(三)RNA的测序

(1)酶裂解法

胰RNase A:嘧啶结尾

米曲霉RNase T1:鸟苷酸结尾

黑粉菌RNase U2:腺苷酸结尾

多头黏菌RNase Phy I:A、G、U结尾

(2)化学裂解法

(3)逆转录成cDNA法

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


五、DNA聚合酶链式反应(PCR)

①模板DNA(单链)

②引物

③DNA聚合酶(Taq)

④dNTP

⑤Mg2+

PCR(MOV)


六、DNA的化学合成

固相合成法(亚磷酸三酯法)合成DNA


合成方向:3′→5′端

5′-OH用二对甲氧三苯甲基(DMT)保护。

3′-OH用氨基亚磷酸化合物活化

碱基上氨基用苯甲酸保护

楚雄师范学院化学与生命科学系 范树国


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