形态学研究及其
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形态学研究及其 方 法 进 展. 宋天保 2006 年 10 月. 形态学研究思路和方法 免疫组化方法进展 基于 PCR 的原位检测技术. 1. 形态学研究思路和方法. 1.1 形态学发展简史. 解剖学的发展 Galen(130 - 200) 《 论解剖过程 》,《 论身体各部器官的功能 》 Vesalius(1514 - 1564) 《 人体的构造 》(1543). 1. 形态学研究思路和方法. 光学显微镜的发明 Leeuwenhoek(1632-1723) Hooke(1635-1702)

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形态学研究及其 方 法 进 展

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形态学研究及其

方 法 进 展

宋天保

2006年10月


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  • 形态学研究思路和方法

  • 免疫组化方法进展

  • 基于PCR的原位检测技术


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1. 形态学研究思路和方法

1.1 形态学发展简史

  • 解剖学的发展

  • Galen(130 - 200) 《论解剖过程》,《论身体各部器官的功能》

  • Vesalius(1514 - 1564)《人体的构造》(1543)


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1. 形态学研究思路和方法

  • 光学显微镜的发明

  • Leeuwenhoek(1632-1723)

  • Hooke(1635-1702)

  • 《显微图谱》(1665)


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1. 形态学研究思路和方法

  • 细胞学说的建立和完善

  • Schleiden(1804-1881)

  • “植物发生论”(1838)

  • Schwann(1810-1882)

  • “关于动植物的结构和生长一致性的显微研究” (1839)

  • Virchow(1821-1902)

  • 《细胞病理学》(1858)

  • “omnis cellula e cellula”


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1. 形态学研究思路和方法

  • 电子显微镜的发明和超微结构研究

  • Knoll和Ruska(1932)

Nobelprize1986


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1. 形态学研究思路和方法

  • 现代形态学的发展

  • 细胞(组织)化学,免疫细胞化学,原位分子杂交,细胞培养等

  • 向定量化、自动化和数字化发展


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1. 形态学研究思路和方法

1.2 形态学的作用和地位

(1)探索生命活动的结构基础

(2)为某些学说的建立提供形态基础

如:神经元学说,肌丝滑动学说

(3)在生命科学研究中的地位逐渐上升

(4)与机能学研究相辅相成

Nobelprize 1906


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1. 形态学研究思路和方法

1.3 形态学研究的思路

(1) 水平:

大体观测(器官)—立体显微镜(组织)--光镜(细

胞)—电镜(亚细胞)--扫描探针显微镜(分子和原

子)

(2)对象:活体—离体培养

—固定组织

(3)方法:


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1. 形态学研究思路和方法

选用形态学方法时的基本思考:

  • 研究目的

  • 有无必要

  • 选用何种方法

  • 有无条件

  • 高质量照片

  • 结合其他资料分析

  • 注意人工假象(预成论,凤汉小体…)


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1. 形态学研究思路和方法

  • 1.4 形态学研究的方法

  • (1)普通光镜术:

  • 常规方法:固定—切片--染色(H-E)

  • 特殊染色:


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1. 形态学研究思路和方法

(2)特殊光镜术:

  • 荧光显微镜

  • 相差显微镜


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1. 形态学研究思路和方法

  • 暗视野显微镜

  • 激光共聚焦扫描显微镜


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1. 形态学研究思路和方法

(3)电镜术:

  • 透射电镜术

  • 扫描电镜术

  • 冷冻蚀刻术


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1. 形态学研究思路和方法

(4)组织(细胞)化学术:

糖,脂类.蛋白,核酸,酶等


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1. 形态学研究思路和方法

(5)放射自显影术:


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1. 形态学研究思路和方法

(6)免疫组织(细胞)化学术:

PAP,ABC,SP


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1. 形态学研究思路和方法

  • (7)原位杂交:

  • 探针:DNA,RNA,ODN

  • 标记物:

  • 放射性核素

  • 非放射性

  • 显示:放射自显影

  • 免疫组化

  • 荧光


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1. 形态学研究思路和方法

(8) 细胞培养术:


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1. 形态学研究思路和方法

(9) 活体与活细胞染色:


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1. 形态学研究思路和方法

(10) 形态研究的定量术:

  • 形态计量术(体视学)

  • 显微分光光度术

  • 图像分析术

  • 流式细胞术


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2. 免疫组化方法进展

2.1 EPOS法(enhanced polymer one step method)

原理:酶(HRP)+惰性聚合物(葡聚糖)→酶标聚合物

+ AB1 →酶-聚合物-AB1

方法:酶-聚合物-AB1→显色。

变法:(rapid microwave

one step method,RAMOS)

加酶-聚合物-AB1→盖玻片

→微波炉→显色


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2. 免疫组化方法进展

特点:只有1步,特异性强;

敏感性高(70 mole酶/1 mole聚合物);

简便、快速; 适用于石蜡、冰冻切片,细胞涂

片等。

RAMOS法还有:

试剂用量少,成本低;

无脱片现象;

无边缘现象,染色均匀。


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2. 免疫组化方法进展

2.2 EnVision法

原理:酶(HRP)+惰性聚合物(葡聚糖)→酶标聚合物

+ AB2 → AB2-聚合物-酶(含100个酶、15个Ab2分子)

方法:AB1→ AB2-聚合物-酶→显色


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2. 免疫组化方法进展

特点:

敏感性高;

背景低(体内无葡聚糖);

孵育时间短(37℃, 15

min),适用于术中

病理诊断;

Ab1最好用单抗,浓

度可大一点


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2. 免疫组化方法进展


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2. 免疫组化方法进展

2.3 CSA法(catalyzed signal amplification)

原理:基本方法为SP法

加用生物素标记酪胺

HRP催化酪胺使之沉积在Ag-Ab结合位点


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2. 免疫组化方法进展

方法:AB1 → AB2-Bio → SA-HRP →酪胺-Bio →

SA-HRP →显色

优点:敏感性高; Ab1稀释度高,背景染色低; 省时;

适用于信号弱的组织(戊二醛固定);

第2次用的SA亦可用荧光素、胶体金、AKP标记;

也可用于放大原位杂交信号.


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

  • 3.1 原位PCR

  • 定义:将PCR的高效扩增与ISH的细胞定位相结合,在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列,同时对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。

  • 分类:

  • 原位PCR:以DNA为起始模板→PCR扩增→检测扩增产物。又分直接法和间接法

  • 原位反转录PCR:以mRNA为起始物→反转录成cDNA→以cDAN为模板行PCR扩增→检测扩增产物。

  • 原位再生式序列复制反应:以mRNA为模板直接扩增RNA靶序列。


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

3.2 直接法原位PCR

特点:PCR扩增时用标记dNTP或引物,使扩增产物直接

标记

标记物:常用同位素、生物素、地高辛

操作程序:

组织细胞制备:固定、预处理

原位扩增:引物, TaqDNA聚合酶,标记dNTP

扩增产物检测:放射自显影,ICC


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

评价:

优点:操作简便、流程短、省时

缺点:特异性差,假阳性率高(固定、包埋、制片等使

标本内DNA受损, DNA修复时,标记dNTP进入非靶

序列;引物与模板的错配)

扩增效率低

不适用于切片标本(切片比细胞标本DNA受损重)


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

3.3 间接法原位PCR

特点:PCR体系中dNTP和引物均不标记

PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交

标记物:以生物素、地高辛较为常用

操作程序:

渗入和原位扩增:dNTP,引物, Taq DNA聚合酶

组织细胞制备:固定、预处理

原位杂交: 用特异性标记探针

扩增产物检测:ICC


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

评价:目前最常用

优点:扩增效率高

特异性强(杂交探针特异性结合靶序列,不与扩增

产物中的非靶序列结合)

可用于细胞制备和石蜡切片标本

缺点:操作复杂


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

举例:石蜡切片,Dig标记

②PCR热循环:94℃ 1’,55 ℃ 1’, 72℃ 1.5’, 25-30个循环, 72℃延伸 10’;

③去盖片,4%多聚甲醛后固定10’;

④ Alc脱水干燥。

原位杂交:

①Dig标记探针,98 ℃变性10’,-20 ℃退火5’,42 ℃杂交过夜;

②洗涤:2×SSC 10’ ×3,1×SSC 10’ ×3,缓冲液洗10’ ×3;

③AKP-Dig-Ab,37 ℃,2h;

④BCIP/NBT显色;

⑤脱水、透明、封固。

标本制备:10%福马林固定,石

蜡切片5 m。

预处理:

①脱蜡至水;

②0.2mol/L HCl,10’;

③5 g/ml 蛋白酶K 37℃ 10’;

④RNase消化37℃ 30’;

⑤Alc脱水干燥。

原位扩增:

①PCR扩增反应液30 l,加盖片封边;


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

3.4 原位RT-PCR

原理:

逆转录酶

mRNA为模板 cDNA

Taq聚合酶

cDNA为模板扩增产物

直接(直接法)或原位杂交(间接法)检测扩增产物

注意:

标本先以DNase处理过夜,破坏DNA

反转录条件42℃,30’-60’

反转录后加热90℃以上灭活逆转录酶


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

程序:

组织细胞制备:10%福马林固定。

预处理:DNase消化过夜;蛋白酶K消化(54℃,20’);95℃,3’灭活蛋白酶K。

逆转录反应:反应液含逆转录酶、引物、dNTPs,并有RNase抑制剂,42℃,30’-60’。 95℃10’灭活逆转录酶。

PCR扩增:加Taq聚合酶、引物、dNTPs扩增;扩增后烤80℃, 15’-30’。

原位杂交:原位杂交后或直接用ICC检测扩增产物。


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

3.5 原位再生式序列复制反应(原位3SR反应)

原理:直接进行RNA扩增,检测细胞内低拷贝mRNA

特点:3种工具酶:AMV逆转录酶、RNase H、T7RNA聚合酶

引物5’端有T7RNA聚合酶启动子

扩增反应42℃,2h,不需热循环

程序:细胞固定、脱水干燥;

制备5’端含T7启动子的引物;

PCR制备标记探针(Dig-11-dUTP);

原位扩增(反应液含引物、dNTPs、3种酶等);

原位杂交(加探针95℃变性10’, 40℃杂交过夜,显色)


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

3.6 原位PCR的对照试验

已知阳性、阴性对照试验

省去或用无关引物替代特异性引物

标本用DNase或RNase预处理

直接、间接原位PCR中省去DNA聚合酶

原位RT-PCR和原位3SR反应中省去逆转录酶


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

3.7 原位PCR的应用

检测内源性基因

固有基因定位--最敏感,低拷贝

异常及变异基因--与遗传性疾病的研究

检测外源性基因

感染(病毒、细菌)基因--诊断

转基因,基因治疗--基因定位、有无突变


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3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR

3.8 原位PCR存在问题及对策

敏感性:在细胞制备高(单拷贝);在切片标本低,扩增效率低

特异性:间接法高,直接法低(假阳性)

原位扩增时采用热启动PCR或套式PCR可提高特异性

引物延伸时掺入Bio-dNTPs→合成的新链体积大→不

易扩散

用针对同一靶序列不同片段的多对引物扩增→多个不

同长度扩增产物重叠交织→不易扩散,且敏感性提高

复杂性:需规范操作,需对照试验,需简化操作

定量分析:尚不成熟


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4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR

4.1 免疫PCR

概述:利用细胞工程和基因工程技术,将Ag-Ab反

应的特异性与PCR的敏感性结合,用以检测Ag分子。

原理:用一中介分子同时结合DNA和Ab,Ab与Ag特异性

结合,DNA用特异引物行PCR扩增,通过显示扩增产

物对Ag进行定性和定量。

与ELISA比较:本质为ELISA,但

作用于底物的酶被结合于Ab的标记DNA分子取代;

酶标显色被PCR扩增取代。

优点:敏感性提高近1万倍,可检测含量极低的Ag。


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4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR

4.2 中介分子的种类

蛋白A(PA)与链霉亲和素(SA)嵌合分子:

利用基因工程表达的嵌合分子

PA可结合IgG Fc段,SA可结合生物素化DNA;

假阳性:PA可能与标本和血清中残留Ig结合

抗体只能是IgG分子

(Ab-Bio)-SA-(Bio-DNA):

将抗体和一段核苷酸分别生物素化,再以SA连接二者

抗体结合Ag,核酸用引物PCR扩增

单链抗体-SA融合蛋白:

利用基因工程将McAb的重链和轻链连接成单链,再与SA连接→

单链抗体-SA


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4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR

4.3 原位免疫PCR

原理:将PCR与免疫组化结合,在组织细胞原位检测抗原:

中介分子连接Ag-Ab复合物和标记DNA→Ag-Ab-DNA复合物→

PCR扩增DNA→检测扩增产物→间接证明Ag存在


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4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR

方法:

石蜡切片脱蜡至水;

0.3%双氧水-甲醇20’;

3 mol/L尿素30’;

10%小牛血清37℃ 30’;

Ab1 37℃ 1-2h; PBS洗;

生物素化Ab2 37℃1h; PBS洗;

SA 1:100, 1h;

生物素化DNA(20ng/片)37℃1h;

PBS洗后行原位PCR扩增(25l反应液加引物, dNTPs, Bio-dUTP, Taq酶等);

ABC法呈色,复染、封片。


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4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR

增加敏感性:

用放射性同位素、荧光素、酶标记物掺入PCR产物

改变Ab和中介连接物浓度

控制PCR循环周期数、改进PCR产物检测方法

注意事项:

防止非特异性:外源性DNA和引物应与被检材料固有及外来基

因无互补序列

用尿素或微波替代蛋白酶消化:防止残存酶对Taq酶的降解

充分洗涤:去除非特异结合

设立阳性、阴性对照


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5. 引物介导的原位标记技术

5.1原理(primed in situ labelling, PRINS)

寡核苷酸引物或变性DNA片段与标本上靶DNA互补复性

在聚合酶作用下单次延伸(用标记dUTP),

新合成DNA即带有标记物,检测。

复性与延伸:引物, dNTP(含标记dUTP),Taq DNA聚合酶

组织细胞制备:固定、预处理

检测:荧光显微镜或ICC


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5. 引物介导的原位标记技术

5.2方法

5.2.1染色体标本

① 新鲜组织块胰酶消化成单细

胞,制备间期核或染色体;

② Alc脱水,空气干燥;

③ 94℃加热,并加上50 l PCR

反应液 (含引物, Bio-11-dUTP,

dNTP, Taq酶), 加盖片, 5 min;

④ 65℃湿盒5’, 0.1×SSC 65℃洗

片5 min;

⑤ 65℃干燥10-20”, EDTA 5 min

终 止反应;

⑥ 4× SSC 含0.1%吐温20 42℃

洗片5 min,2次;

⑦ 30%BSA封闭20 min;

⑧ FITC-亲合素或CY5-亲合素

37℃30’;

⑨ SSC (4× 42℃ 5 min 2次,

2×5 min)洗片;

⑩复染,甘油封片; 荧光显微镜

观察。


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5. 引物介导的原位标记技术

5.2.2石蜡切片

⑥ SSC洗 (0.1× 65℃5 min, 4×

42℃5min,2次);

⑦ 20%羊血清封闭30 min;

⑧ 地高辛抗体复合物, RT 2h;

⑨ 洗后用BCIP/NTB显色1-2h;

⑩中性红复染,封片。

① 脱蜡至水;

② 0.2mol/L HCl,5’;

③ 25 g/ml 蛋白酶K 37℃ 15’;

④ Alc脱水干燥;

⑤ PCR反应液25 l (含引物,

dNTP, Dig-11-dUTP, Taq酶),

加盖片, 94℃变性5 min, 65℃湿

盒5 min;

结果:阳性信号蓝紫色,

背景细胞核红色


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5. 引物介导的原位标记技术

  • 5.3对照试验

  • 阳性对照:已知阳性细胞或组织;

  • 阴性对照:

  • 不加标记的dUTP;

  • 不加引物;

  • 不加Taq聚合酶


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5. 引物介导的原位标记技术

  • 5.4评价

  • 快速(扩增只需5~10 min,全程只需1~3h);

  • 简便(Taq酶驱动的单次延伸,只需特异性引物,不需探针);

  • 特异性高(避免原位PCR中标本上受损DNA修复引起的非特异

  • 性延伸和扩增,特异片段延伸和信号显示强而稳定);

  • 既可用于细胞和染色体标本,也可用于组织切片;

  • 可使用Dig-11-dUTP,代替荧光标记,可用普通显微

  • 镜,便于推广和避免荧光褪色。


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