Perché fare diagnosi di laboratorio ?

1. Perché fare diagnosi di laboratorio ? • formulazione di una diagnosi eziologica non diagnosi di polmonite ma polmonite daadenovirus… • adozione di una terapia mirata • individuazione dei casi sentinella in occasione di epidemie • scopi epidemiologici

2. Diagnosi eziologica delle malattie virali (approcci) dimostrazione nel materiale patologico dell’agente infettivo o suoi componenti Diagnosi diretta dimostrazione nell’organismo infettato di una risposta anticorpale specifica Diagnosi indiretta

3. diagnosi indiretta • Dimostrazione che è in atto una risposta immune all’agente infettivo • in genere valutando la dinamica anticorpale mediante reazioni sierologiche • presenza IgM indice di infezione recente • rivelabili dopo 7-10 giorni dall’infezione • breve permanenza (2-3 mesi) • Presenza solo IgG indice di infezione contratta in passato • rivelabili dopo 2-4 settimane dall’infezione • permangono per anni

4. Diagnosi indiretta 1. dimostrazione di anticorpi specifici della classe M (IgM) in un singolo campione disiero 2. dimostrazione di sieroconversione (negativo  positivo) o di incremento del titolo anticorpale di almeno 4 volte in 2 campioni prelevati • 1° - in fase acuta della malattia • 2°- in fase convalescente (2-3 settimane più tardi)

6. Diagnosi indiretta - saggi sierologici • agglutinazione • precipitazione • fissazione del complemento • neutralizzazione • inibizione dell’emagglutinazione (virus emagglutinanti) • IF immunofluorescenza • RIA radioimmunoassy • test immunoenzimatici ELISA, immunoblot

7. Inibizione della emagglutinazione diluizioni scalari del siero in esame + quantità standard di unità emagglutinanti del virus (incubazione) + sospensione di globuli rossi titolo degli Ab inibenti emoagglutinantinazione  la più alta diluizione del siero capace di prevenire emoagglutinazione

8. Immunofluorescenza indiretta cellule infettate da virus siero in esame legame Anticorpi anti IgG o anti IgM umane-fluoreseceinati

9. Test indiretto per le IgG Ag virale siero in esame (oppure diluizioni scalari del siero) anti IgG umane-Enzima substrato viraggio colore ELISA

11. Diagnosi indiretta: punti critici • riattivazione di virus latenti • pazienti immunodepressi • difficoltà di disporre di un siero “acuto” o “convalescente”

12. Tipo dimetodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti

13. Tipo dimetodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti

14. Tipo dimetodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti

16. Isolamento in colture cellulari allestimento delle colture in vitro inoculazione del campione incubazione identificazione e tipizzazione del virus

17. Identificazione e tipizzazione dei virus effetto citopatico (CPE) caratteristiche antigeniche sequenze genomiche • degenerazione cellulare • cellule multinucleate o sincizi • formazione di inclusioni • tipo di cellule sensibili • tempo di comparsa • velocità di progressione dell’infezione

20. Inclusioni Localizzazione • nucleo (adenovirus, herpesvirus) • citoplasma (virus della rabbia, poxvirus) • entrambi (CMV, paramixovirus) Tipo • ammassi virioni (papovavirus) • viroplasma (poxvirus) • materiale cellulare proteico (adenovirus)

21. identificazione e tipizzazione dei virus effetto citopatico (CPE) caratteristiche antigeniche sequenze genomiche reazioni sierologiche

22. identificazione e tipizzazione dei virus effetto citopatico (CPE) caratteristiche antigeniche sequenze genomiche • ibridazione con sonde molecolari • reazioni di amplificazione

23. Tipo dimetodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti

24. Diagnosi diretta - ricerca degli antigeni • agglutinazione • precipitazione • fissazione del complemento • neutralizzazione • emagglutinazione (virus emagglutinanti) • IF immunofluorescenza • RIA radioimmunoassy • test immunoenzimatici: ELISA, immunoblot

25. Immunofluorescenza diretta materiale patologico Anticorpi virus specifici -fluoreseceina

26. IDENTIFICAZIONE DI ANTIGENE DI CITOMEGALOVIRUS SU LEUCOCITI POLIMORFONUCLEATI DEL LIQUOR MEDIANTE IMMUNOFLUORESCENZA CON ANTICORPO MONOCLONALE ANTI-pp65.

27. Tipo dimetodo Ricerca dei virioni al M.E. Ricerca dell’infettività virale Ricerca degli Ag virali Ricerca del genoma virale Diagnostica virologica metodi diretti definizione Dimostrazione del virus o suoi componenti

28. Ricerca del genoma virale Quali virus ? difficilmente o non coltivabili (HBV, HCV, papillomavirus, parvovirus B19, HAV) a lento sviluppo (CMV, BKV, JCV) pericolosi da coltivare (HIV) emergenti (TTV)

29. Ricerca del genoma virale Ibridazione 100 000 - 10 000 genomi amplificazione  ibridazione 10 - 1 genomi

30. Ibridazione con sonde

32. Tecniche quantitative • Per distinguere infezione latente da infezione attiva • Per il monitoraggio dell’infezione • Per il monitoraggio della terapia • Per valutare il rischio di trasmissione