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DEFERIPRONA Y IDEBENONA RECUPERAN LOS FENOTIPOS DE LA REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH. Jose V. Llorens, Sirena Soriano, M.J. Martínez, M.D, Moltó Departamento de Genética, Universidad de Valencia. Drosophila como modelo de enfermedades humanas.

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DEFERIPRONA Y IDEBENONA RECUPERAN LOS FENOTIPOS DE LA REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Jose V. Llorens, Sirena Soriano, M.J. Martínez, M.D, Moltó

Departamento de Genética, Universidad de Valencia


Drosophila como modelo de enfermedades humanas
Drosophila REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICHcomomodelo de enfermedadeshumanas

  • Fácilmanejo / Cortociclo de vida

  • Más de 100 años de genética: genomamejoranotado

    • > 60% de los genes responsables de enfermedadeshumanastienen un ortologo en Drosophila

  • Multiples herramientasmutagénicas / Mutantesdisponiblespara un grannúmero de genes

  • Gran conocimiento del sistemanervioso y de sudesarrollo


Frataxina una prote na altamente conservada
Frataxina REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH, unaproteínaaltamenteconservada

Bencze et al. 2006


Un modelo en drosophila de af

A1 REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

A3

A2

Un modelo en Drosophila de AF

cromosoma X

Cañizares et al. 2000, Llorens et al. 2007


Un modelo en drosophila de af1

UAS REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

fh

Un modelo en Drosophila de AF

GAL4 driver (actin-GAL4)

UAS - responder (UAS-fhIR)

X

Promoter

GAL 4

UAS

fh

actin-GAL4/UAS-fhIR

hf

Promoter

GAL 4

hf


Un modelo en drosophila de af2
Un modelo en Drosophila de AF REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

qRT PCR

fh

hf

GFP fragment

650 pb

650 pb

500 pb

2-ΔΔCt

fh-RNAi

control

Llorens et al. 2007


Un modelo en drosophila de af3
Un modelo en Drosophila de AF REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

qRT PCR

Supervivencia normoxia

control

fh-RNAi

% survivals

100

days

80

60

2-ΔΔCt

40

20

fh-RNAi

control

0

0 20 40 60 80 100

Llorens et al. 2007


Un modelo en drosophila de af4
Un modelo en Drosophila de AF REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

qRT PCR

Supervivencia normoxia

control

fh-RNAi

% survivals

Speed (cm/s)

Test escalada normoxia

100

days

80

60

2-ΔΔCt

40

20

fh-RNAi

control

fh-RNAi

control

0

0 20 40 60 80 100

Llorens et al. 2007


Un modelo en drosophila de af5
Un modelo en Drosophila de AF REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

qRT PCR

Supervivencia normoxia

control

control

fh-RNAi

fh-RNAi

% survivals

Speed (cm/s)

Test escalada normoxia

Supervivencia hiperoxia

% survivals

100

days

80

60

2-ΔΔCt

40

days

20

fh-RNAi

control

fh-RNAi

control

0

0 20 40 60 80 100

Llorens et al. 2007


Actividad de las enzimas aconitasa y sdh
Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Actividad aconitasa normoxia

Isocitrate

dehydrogenase

Ciclo de Krebs

control

1 día

fh-RNAi

1 día

control

15 días

fh-RNAi

15 días

control

25 días

fh-RNAi

25 días

Llorens et al. 2007


Actividad de las enzimas aconitasa y sdh1
Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Actividad aconitasa normoxia

Isocitrate

dehydrogenase

Ciclo de Krebs

Actividad SDH normoxia

fh-RNAi

5 días

control

1 día

fh-RNAi

25 días

fh-RNAi

1 día

control

5 días

control

25 días

control

1 día

fh-RNAi

1 día

control

15 días

fh-RNAi

15 días

control

25 días

fh-RNAi

25 días

Llorens et al. 2007


Actividad de las enzimas aconitasa y sdh2
Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Actividad aconitasa

***

Isocitrate

dehydrogenase

Ciclo de Krebs

control

normoxia

fh-RNAi

normoxia

fh-RNAi

hyperoxia

control

hyperoxia

Llorens et al. 2007


Actividad de las enzimas aconitasa y sdh3
Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Actividad aconitasa

***

Isocitrate

dehydrogenase

Ciclo de Krebs

Actividad SDH

fh-RNAi

normoxia

control

hyperoxia

fh-RNAi

hyperoxia

control

normoxia

control

normoxia

fh-RNAi

normoxia

fh-RNAi

hyperoxia

control

hyperoxia

Llorens et al. 2007


Actividad de las enzimas aconitasa y sdh4

control REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

inactivo

control

activo

control

inactivo

control

activo (+ATP)

fh-RNAi

activo

fh-RNAi

inactivo

fh-RNAi

activo

fh-RNAi

inactivo

hiperoxia

normoxia

Actividad de las enzimas Aconitasa y SDH

Actividad aconitasa

***

Respiración (Consumo de O2)

***

control

normoxia

fh-RNAi

normoxia

fh-RNAi

hiperoxia

control

hiperoxia

Llorens et al. 2007


Objectivos
Objectivos REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

  • Probar el efecto de moléculas terapéuticas que dan resultado positivo en ensayos clínicos con pacientes con AF sobre los fenotipos observados en los mutantes de Drosophila.

  • Validar nuestro modelo para realizar el screening de nuevas moléculas terapéuticas para el tratamiento de la AF.


Tratamientos de la af
Tratamientos de la AF REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

curefa.org


Deferiprona
Deferiprona REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

  • Quelante de hierro con permeabilidad de membrana

  • Transfiere el hierro quelado al aceptor transferrina

  • Atraviesa la barrera hematoencefálica

  • Boddaert et al. 2007

    • Decrecimiento en la acumulación de hierro en el núcleo dentado en pacientes de AF

    • Mejora neurológica (apreciado por pacientes y familiares, ICARS scores)

    • No hay cambios significativos en parámetros asociados al hierro en sangre


Idebenona
Idebenona REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

  • Benzoquinona estructuralmente relacionada con el coenzima Q10

  • Transportador de electrones en la CTE mejorando la función respiratoria y el metabolismo energético en la mitocondria

  • Antioxidante, inhibe la peroxidación lipídica

Meier et al. 2009


Idebenona1
Idebenona REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICH

Reviewed in Schulz et al. 2009


  • Concentrationes REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICHtestadas

    • Deferiprona: 65 and 163 µM

    • Idebenona: 7, 15 and 30 µM

  • Comienzo del tratamiento

    • Embriones 0-24h

    • Moscasadultastras la emersion de la pupa

  • Cepas GAL4 usadas

    • actin-GAL4: expresiónubicua

    • neur-GAL4: expresión en el SNP

  • Experimentosllevados a cabo

    • Longevidad y escalada

    • Actividadaconitasa en hiperoxia


La deferiprona mejora la supervivencia y la habilidad motora de mutantes actin gal4 uas fh ir
La REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICHdeferipronamejora la supervivencia y la habilidadmotora de mutantesactin-GAL4 > UAS-fhIR


La deferiprona mejora la supervivencia y la habilidad motora de mutantes neur gal4 uas fh ir
La REDUCCIÓN DE FRATAXINA EN UN MODELO EN DROSOPHILA DE LA ATAXIA DE FRIEDREICHdeferipronamejora la supervivencia y la habilidadmotora de mutantesneur-GAL4 > UAS-fhIR



La idebenona recupera la actividad aconitasa de mutantes actin gal4 uas fh ir mutants en hiperoxia
La idebenona recupera la actividad aconitasa de mutantes de mutantes actin-GAL4>UAS-fhIR mutants en hiperoxia


Ni la deferiprona ni la idebenona afectan al sistema de expresi n uas gal4

UAS de mutantes

fh

Ni la Deferiprona ni la Idebenona afectan al sistema de expresión UAS-GAL4

GAL4 driver (actin-GAL4)

UAS responder (UAS-fhIR)

X

Promoter

GAL 4

UAS

fh

actin-GAL4/UAS-fhIR

hf

Promoter

GAL 4

hf


La deferiprona no tiene ning n efecto sobre la expresi n del gen fh
La Deferiprona no tiene ningún efecto sobre la expresión del gen fh

En Drosophila, no hay diferencias significativas en la expresión de frataxina tras el tratamiento con Deferiprona.


Conclusiones
Conclusiones del gen

  • La Deferiprona y la Idebenonamejoran la supervivencia y la habilidadmotora de lasmoscasmutantes.

  • La Idebenonapero no la Deferipronarecupera la actividad de la enzimaaconitasa en hiperoxia.

  • Estasmejoras son debidas a los tratamientos con los medicamentos per se y no al efecto de estossobre el sistema UAS-GAL4.

  • Los resultadosconfirman la validez de nuestromodelo en Drosophila de la AF para el desarrollo de screenings farmacológicos de nuevasmoléculas con propiedadesfarmacológicas.


Departament of Genetics del gen

Universitat de València

Universität Regensburg

Lehrstuhl für Entwicklungsbiologie

Prof. Dr. Mª Dolores Moltó Ruiz

Prof. Dr. Mª José Martínez Sebastián

Dr. José Vicente Llorens Llorens

Sirena Soriano Rodríguez

Prof. Dr. Stephan Schneuwly

Dr. José Antonio Botella Muñoz

Dr. Juan Antonio Navarro Langa


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