Design de Primers..
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Design de Primers. Serve como um ponto de partida para a replicação de DNA. A DNA polimerase não é capaz de iniciar a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir de zero, podendo apenas adicionar a uma cadeia de nucleotídeos existentes. Primers determinam o sucesso de uma PCR!.

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Presentation Transcript


Design de primers

Design de Primers..


Design de primers

Serve como um ponto de partida para a replicação de DNA. A DNA polimerase não é capaz de iniciar a síntese de uma nova cadeia de DNA a partir de zero, podendo apenas adicionar a uma cadeia de nucleotídeos existentes.


Design de primers

Primers determinam o sucesso de uma PCR!

Specificity?

Proper annealing to the template?


Design de primers

  • Comprimento do Primer

  • Determina especificidade e afeta seu

  • anelamento com o DNA molde!

  • Muito curto -> baixa especificidade, resultando em amplificação não específica

  • Muito longo -> diminui a eficiência de ligação ao DNA molde em temperatura normal de anelamento devido à maior probabilidade de formação de estruturas secundárias, como grampos.

  • Comprimento ideal:

    • 18-24 bp para PCR comum

    • 30-35 bp para PCR multiplex


Design de primers

  • Tamanho do amplicon

    • 150-1000 bp para PCR comum, evitar >3 kb

    • 50-150 bp para qPCR, evitar >400 bp

    • Evitar amplicons muito curtos para poder distingui-los de possíveis dímeros de primers!


Design de primers

Temperatura de melting (Tm)

  • A temperatura na qual 50% da dupla fita de DNA se dissocia para fita simples.

  • Determinado pelo comprimento, composição de base e concentração dos primerse pela concentração de sal no PCR mix

  • Cálculo aproximado: Tm = 2(A+T) + 4(G+C) °C (indicado para <18mer)

  • Utilizado para cálcular a temperatura de anelamento (Ta):

  • Ta Opt = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of PCR product) – 25

  • Regra geral: Ta = Tm-5°C


Design de primers

Temperatura de anelamento(Ta)

  • Ta ótima

  • 52°C - 60°C

  • Ta baixo aumenta a eficiência da PCR mas diminui a especificidade

  • Taalto aumenta a especificidade mas diminui eficiência da PCR.

  • Ta>65°C pode ser recomendado para a amplificação de alvos com elevado conteúdo de GC.

  • Diferenças de Ta entre o par de primers

  • Incompatibilidade significativa do par de primers pode levar à má amplificação

  • Desejável diferença Ta <5°C


Design de primers

Para determinar a Ta ótima sempre testar os primers pela 1ª vez em pelo menos 3 diferentes temperaturas (ex. a Ta indicada pelo fabricante ou calculada +/- 2°C)e correr gel!

Escolher a máxima temperatura em que há apenas 1 banda (e do tamanho esperado!) e a amplificação ainda é satisfatoria!


Design de primers

Especificidade e homologiacruzada

  • Especificidade

  • Determinada principalmente pelo comprimento do primer assim como sua sequência

  • A adequação da especificidade do primer é relativo à natureza do DNA molde utilizado na reação de PCR.

  • Homologia Cruzada

  • Pode ser um problema quando o molde de PCR é o DNA genômico ou consiste de fragmentos de genes mistos.

  • Os iniciadores contendo a sequência altamente repetitiva são propensos a gerar produtos de amplificação não específicos, quando a amplificação de DNA genômico.


Design de primers

  • Para evitar amplificação não específica..

  • Além da temperatura e comprimento ideal dos primers:

  • BLAST dos iniciadores contra banco de dados NCBI de sequência não-redundante é uma maneira comum de evitar projetar primers que podem amplificar regiões homólogas inespecíficas.

  • Para PCR: Iniciadores que flanqueiam a junção intron-exon, para evitar a amplificação não-específica devido à contaminação por cDNA.

  • Para qPCR: Iniciadores que flanqueiam a junção exon-exon para evitar amplificação inespecífica devido à contaminação por gDNA.


Design de primers

Conteúdo CG e repetições

  • Conteúdo G/C do Primer

  • Conteúdo ideal de G/C: 45-55%

  • Conteúdo semelhante para o par de primers

  • Recomendado C ou G na extremidade 3’ (aumentar eficiência ligação)

  • Runs (streches de base única, exaaaaaaa)

  • Repetições longas aumenta o potencial de anelamento inespecífico

  • O número máximo aceitável de repetições é de 4 bp

  • Repetições (streches de di-nucleotídeos

  • consecutiva, ex. acacacac)

  • Repetições aumenta o potencial de

  • anelamento incorreto/inespecífico

  • O número máximo de repetições aceitável

  • é de 4 di-nucleotídeos


Design de primers

Complementaridade - Estruturas 2árias dos primers

  • Atrapalham a ligação primer-molde, levando a pouca ou nenhuma amplificação

  • Análise de ΔG aceitável (energia livre necessária para quebrar a estrutura)

  • Grampos

  • Formados por interações intra-moleculares no mesmo primer

  • Auto-dímero (homodímero)

  • Formado por interações inter-moleculares entre dois iniciadores iguais

  • Cross-dímero (heterodímero)

  • Formado por interações inter-moleculares entre os primers sense e antisense


Design de primers

Softwares..

Primer3 (gratuito)


Design de primers

Primer BLAST (NCBI) – importante principalmente para fazer scan genômico e avaliar possíveis anelamentos inespespecíficos


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