Introdução à Biotecnologia

1. Introdução à Biotecnologia Prof. Dr. Marcelo Lancellotti

2. Biotecnologia • Conjunto de conhecimentos/técnicas para produção de bens com natureza Biológica.

3. Biotecnologia

4. Técnicas / Bens • Genética, Bioquímica, Biologia Celular, Biologia Molecular,Genômica • Tecnologia de Processos • Nanotecnologia • Bioinformática • Robotica

5. HISTÓRICO • 6000 – 2000 aC – panificação e bebidas fermentadas por egípcios,sumérios, babilônicos e gregos • 1875 dC – Louis Pasteur : queda da Teoria da Geração Espontânea e início dos processos de fermentação/esterilização.

6. HISTÓRICO • Processos fermentativos e produção de antibióticos em larga escala

7. Áreas

8. Tecnologia do DNA recombinante Professor Doutor Marcelo Lancellotti

9. Histórico • 1928 – Experimentos de transformação no pneumococo • 1953 – descoberta da estrutura do DNA • Década de 70 e 80 avanços na tecnologia do DNA • (Paul Berg, Stanley N. Cohen, Herbert Boyer) • Técnicas de clonagem, expressão de genes sequenciamento genômico

10. Histórico • Descoberta e utilização de exonucleases de restrição (enzimas de restrição) • (endonucleases do tipo II • BamHI, EcoRI, SmaI, NotI) • Descoberta e utilização das ligases • (T4 DNA ligase por exemplo)

12. Técnicas de Manipulação de DNA • Clonagem e expressão de Genes • Vetores de clonagem e expressão • Vetores virais (cosmídios e fagos) • Vetores cromossômicos

13. Vetores de Clonagem Vetores Plasmidiais

14. Vetores Plasmidiais • Fragmentos de até 15000 pb • Necessidade de inserção em linhagens bacterianas para replicação do inserto clonado no plasmídio • Preparação de receptores competentes

16. pBR322 • Seleção por perda de resistência • Insertos de maiores tamanhos (cerca de até 5Kb) • Réplicas de placas (sistema de transferência com o veludo)

17. pUC18/19 • Seleção por perda de coloração das colônias com plasmídios contendo o inserto de interesse • Fragmentos de até 3kb (perda de eficiência da ligação) • Facilidade em sequenciar os fragmentos clonados

19. Vetores de expressão • Inserção do gene de interesse sobre o controle de um promotor forte (expressão da proteína alvo); • Fusão do gene alvo com genes reporters, sequências protéicas (lacZ, gfp, his-tag)

20. Vetores de Expressão

21. Vetores de natureza viral Cosmídios e Fagos

22. Vetores Virais • Insertos maiores que em plasmídios (até 23000 pb para fagos) • Empacotamento do fago in vitro

24. empacotamento cII cro O cI P Fago N Q cIII Fago  48,514 kb SR Rec Head Tail AWbcNu3DEFiFiiZU V G Thmlki J att int xis    cIII N cI cro cII O P Q SR Head Tail Recombinação Regulação Replicação Lise

25. Cosmídios • Derivados principalmente do fago λ; • Clonagem de grandes fragmentos cromossômicos ou de DNA (45000pb); • Empacotamento in vitro (região cos) • Pode ser inserido em bactérias por transformação ou indução de ciclo lítico (fago)

26. Cosmídios cos Região cos : empacotamento das pastículas virais cos Ap Ciclo Lítico necessário Utilização em bactéria e fago (shuttle) Região de polylinker Genes de seleção por resistência à antibióticos ori

29. Clonagem gênica em plantas • Plasmídios Ti de Agrobacterium tumefasciens • Genes de resistência à pragas • Genes codificantes para imunoglobulinas • Epítopos antigênicos de patógenos

30. A.tumefasciens - patogênica

31. Formação do Tumor em A. tumefasciens

33. Vetores Cromossômicos • YAC (Yeast Artificial Chromosomes) • BAC (bacterial artificial chromosomes) • PAC (plant artificial chromosomes)

34. Vetores Cromossômicos • Clonagem de maiores fragmentos de DNA • Possibilidade de glicosilação após transcrição da proteína alvo • Existência de vetores shuttle antre bactérias (Escherichia coli)

35. YAC’s

36. YAC’s

37. BAC’s

38. pGEMT Easy Clone

39. Southern Blot

40. Southern Blot