טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית

1. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית • 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים • 2. שיבוט cloning - : טכניקה לבידוד מקטע DNA • 3. ריצוף DNA (sequencing) • 4. PCR • 5. microarray)ביו-ציפ (.

3. אנזימי רסטריקציה

5. Cohesive = מתלכד 5’ overhang 3’ overhang

7. cloning

9. polylinker

10. פלסמיד השיבוט

13. Plasmid cloning

14. האם ניתן לשבט מקטע דנא שנחתך בשתי קצוותיו באינזים שחותך קצה ישר (blunt ends) לתוך פלסמיד שגם הוא נחתך עם אותו אינזים רסטריקציה? אי אפשר כי אין נקודת אחיזה אפשר כי מבחינה הסתברותית קצה ישר יגיע למגע עם קצה ישר שני

15. כמה אפשריות חיבור (אורינטציות) יש בין פלסמיד שנחתך באינזים רסטריקציה שיוצר קצוות ישרים (blunt) לבין רצף שני של DNA שנחתך באותו אינזים • 1. אחד • 2. שניים • 3. שלוש • 4. ארבע

16. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית • 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים • 2. שיבוט • 3. ריצוף DNA (sequencing) • 4. PCR (polymerase chain reaction) • 5. microarrayביו-ציפ.

17. Taq polymerase

18. PCR – polymerase chain reaction 30 sec for 1Kb = elongation

19. PCR first PCR-2 PCR In vitro mutagenesis / site-directed mutagenesis – מומלץ לצפייה Creating transgene mouse

20. Site-directed mutagenesis

21. The PCR product on the gel

22. http://www.tau.ac.il/~gilast/ עזרה בתרגיל F R תרגיל בשיבוט-2010 אורך פריימר לא פחות מ-18 בסיסים תכנון פריימרים למוטציה שונה מתכנון פריימרים להגברת מקטע כלשהו ביום ראשון לא יהיה שיעור

23. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית • 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים • 2. שיבוט • 3. ריצוף DNA (sequencing) • 4. RCP • 5. microarrayביו-ציפ.

24. DNA sequencing

25. ריצוף דנא - SEQUENCING

26. מכשיר ריצוף DNA אוטומטי

27. ריצוף הגנום האנושי

28. גרג וונטר

29. Deep sequencing: the technology

30. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית • 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים • 2. שיבוט • 3. ריצוף DNA (sequencing) • 4. RCP • 5. microarrayביו-ציפ.

31. Principle of Microarray (Chip) Assay Prehybridization Posthybridization Synthetic DNA probes Probes with hybridized DNA

32. microarray Genome microarray

33. כל נקודה מצינת גן מאוקטב. סוג הצבע ורמתו מיצגים את רמת הפעלת הגן

34. Antibody Binding sites TF TF Genomic Arrays ChIP-on-chip

35. ChIP-seq in a nutshell

36. טכניקות מחקר בביולוגיה מולקולרית • 1. הפרדת חלבונים על ידי ג'לים • 2. שיבוט • 3. ריצוף DNA (sequencing) • 4. PCR • 5. microarrayביו-ציפ.

37. Gel electrophoresisג'לים • 1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS • 2. ג'ל דנטורטיבי DNAאו RNA – אוראה או פורמאמיד • 3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNAבתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNAאו DNAלא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

38. הפרדות על גבי ג'לים

39. Gel electrophoresisג'לים • 1. ג'ל דנטורטיבי חלבונים – SDS • 2. ג'ל דנטורטיבי DNAאו RNA – אוראה או פורמאמיד • 3. ג'ל נטיבי (מצבו הטיבעי של חלבון/DNA/RNAבתא) לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון, חלבון-RNAאו DNAלא מוסיפים חומרים הגורמים לדנטורציה.

40. Native gel

41. תרגיל בשיבוט – ד.נ.א רקומבינטיבי 1. הוטל עליך לשבט חלק מהרצף הגנומי של הגןsurvival of motor neuron 1 (SMN1) מאקסון 7 עד אקסון 9 (כולל). הרצף המופיע בתמונה הוא רצף pre-mRNA הנגזר מתוך הרצף הגנומי העומד לרשותך (האם ה-3’ UTR הוא חלק מאקסון 8?). 2. כמו כן לרשותך פלסמיד אשר לתוכו תשבט את הרצף הנדרש באתר ה- polylinker (תמונה 2). 3. במעבדה שלושה אינזימי חיתוך (רסטריקציה) ואתרי החיתוך שלהם מופיעים בתמונה מספר 3. 4. כמו כן במעבדה קיים האנזים RNA polymerase T7בלבד שישמש אותך בהמשך המחקר בסנטזת ה-ר.נ.א של הגן המשובט. 5. כיצד תשבט את אקסון 7 עד 9 (כולל) של הגן SMN1 : פרט כל שלב ושלב (מהגברת מקטע הגן עצמו ועד שלב הפקת הפלסמיד), באיזה אנזימים תשתמש, רשום את רצף שני הפריימרים שתזמין, ומה יהיה עליך להזמין בנוסף על כך ? 6. מה יהיה עליך לעשות על מנת לקבל את ה pre-mRNA של הגן (אך ורק אותו!) ? • הערה: ניתן לסנטז את ה pre-mRNA במבחנה (in-vitro), אז כיצד תסנטז את רצף ה-pre-mRNA מבלי לסנטז את רצף הפלסמיד שנמצא downstream לאקסון מספר 9? • במעבדה ישנו מכשיר PCR, קיט תעשייתי להפקת פלסמיד (מאפשר להפיק פלסמיד מכמות גדולה של חיידקים) וכמו כן ניתן להזמין פריימרים (רצפי התחל). • ראקציית ה- PCR מתבצעת ע"י ערבוב החומרים והכנסתם למכשיר ה- .PCR

42. תמונה 1: רצף גנומי חלקי של הגן survival of motor neuron 1 . (SMN1) Exon – red upper case Intron – black lower case Amino acids –under the center of the codon

43. תמונה 2: פלסמיד השיבוט polylinker

44. תמונה 3: אתרי חיתוך של שלושה אינזימי רסטריקציה 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ G AATTC 3’ 3’ CTTAA G 5’ EcoRI 5’ GGATCC 3’ 3’ CCTAGG 5’ 5’ G GATCC 3’ 3’ CCTAG G 5’ BamHI 5’ CTCGAG 3’ 3’ GAGCTC 5” 5’ CTCGA G 3’ 3’ G AGCTC 5’ XhoI Products generated by restriction enzymes Cohesive ends