Mikroskop i mikroskopiranje

1. Mikroskop i mikroskopiranje

2. Mikroskop • opticki instrument za posmatranje objekata manjih od 0,1mm (nevidljivih golim okom) • Osnovni tipovi mikroskopa: • svetlosni mikroskop (mikroskop sa svetlim poljem) • mikroskop sa tamnim poljem • mikroskop sa faznim kontrastom • fluorescentni mikroskop • elektronski mikroskop

3. Svetlosni mikroskop • Uveličanje lika objekta do 2000x • radi na principu propustanja svetlosnog snopa • Osnovni delovi mikroskopa: • mehanički: postolje, stativ sa ručicom, tubus, revolverski uredjaj, stočic, nosač uredjaja za osvetljenje i zavrtnji (makrometarski, mikrometarski i kondenzorski) • optički: izvor svetla, kondenzorsko sočivo, objektiv, okular, dijafragma

4. Svetlosni mikroskop

5. Mehanički delovi mikroskopa • Postolje - deo na kojem stoji mikroskop i na koji se nastavlja stativ • Stativ - srednji deo naziva se ručica (prihvatanje i prenošenje mikroskopa), na bočnoj strani su makrometarski i mikrometarski zavrtnji (fokusiranje objekta) • Makrometarski zavrtanj - grublje fokusiranje (pronalaženje lika) • Mikrometarski zavrtanj - izostravanje detalja lika • Tubus - nastavlja se na gornji deo stativa, na gornjem delu tubusa okular, a na donjem revolverski uredjaj sa objektivima

6. Mehanički delovi mikroskopa • Stočic – površina na koju se stavlja predmetnica, odnosno objekat posmatranja, sadrži centralni otvor kroz koji prolazi svetlosni snop iz kondenzora i osvetljava uzorak, ležište za predmetnicu (bočni fiksirani graničnik i opruga)

7. Optički delovi mikroskopa • Kondenzorsko socivo – smešteno ispod stočića, podizanjem i spuštanjem koje se ostvaruje bočno postavljenim zavrtnjem reguliše se intenzitet svetla kojim se prosvetljava objekat, dodatni delovi blenda i filter • Objektivska sočiva – sistem uzajamno centriranih sočiva smeštenih u metalnu cev • frontalno sočivo (najblize preparatu), sva ostala •korekciona (odstranjivanje nedostataka koji nastaju prilikom stvaranja lika) • razlikuju se po moci uvećanja (odnos izmedju stvarne i prividne veličine objekta) i • moći razdvajanja (najmanje rastojanje izmedju 2 tačke koje se razlikuju kao odvojeni objekat)

8. Optički delovi mikroskopa • Objektivska sociva •suva – izmedju frontalnog sočiva i objekta koji se posmatra je vazduh, manja uvećanja (10x, 40x) •imerziona – izmedju frontalnog sočiva i preparata imerziono ulje (ne dolazi do prelamanja svetlost, indeks prelamanja sličan indeksu prelamanja stakla) • Okulari – smešteni na gornjem delu tubusa • sastoje se od 2 sociva, sabirnog – donje, okrenuto prema objektu • očnog sočiva – gornje, okrenuto prema oku posmatrača

9. Optički delovi mikroskopa imerziona objektivska sociva – izmedju frontalnog sočiva i preparata imerziono ulje (ne dolazi do prelamanja svetlost, indeks prelamanja sličan indeksu prelamanja stakla

10. Lik posmatranog objekta • lik koji obrazuje objektiv – uvećan, stvaran, izvrnut u odnosu na posmatrani objekat; ne posmatra se direktno, već posredstvom okulara koji funkcioniše kao lupa • lik koji obrazuje okular – imaginaran, uvećan • ukupno uvećanje mikroskopa jednako je proizvodu uvećanja objektiva i okulara

11. The light patway of a microscope

12. Mikroskopiranje • Fiksirani, bojeni preparati •lik se nadje na malom uvećanju • na preparat se nanosi kap imerzionog ulja, mikroskopira se imerzionim objektivom • kondenzor se dovodi u gornji položaj (maksimalni intenzitet svetlosti), lik se dobija pažljivim okretanjem mikrometarskog zavrtnja • Nativni preparati • postupak mikroskopiranja potpuno isti kao kod bojenih preparata, s tom razlikom što se kondenzor udanjava od predmetnice (smanjuje se intenzitet svetlosti, kako bi se videli transparentni mo)

13. Mikroskop sa tamnim poljem • objekat osvetljen kosim zracima, svetlost ne dolazi do objektiva • do oka dopire prelomljena svetlost sa objekta • objekti su svetli u tamnom vidnom polju • primena specijalnog kondenzora sa zatamnjenim centralnim delom (svetlosni zraci ne osvetnjavaju objektiv) • posmatranje sitnih transparentnih mo, koji su van moći razdvajanja svetlosnog mikroskopa

14. Mikroskop sa tamnim poljem primena specijalnog kondenzora sa zatamnjenim centralnim delom

15. Mikroskop sa tamnim poljem

16. Mikroskop sa tamnim poljem posebno korisna tehnika kada je u pitanju posmatranje spiroheta

17. Mikroskop sa faznim kontrastom • Zernikeov mikroskop • posmatranje živih, neobojenih mo i njihovih organela • na bojenim preparatima moguće uočiti organele, ali mo nisu živi • princip mikroskopiranja zasnovan na osobini ćelija da imaju različit indeks prelamanja svetlosti od okolne sredine • amplitudni objekti-tamni, amplituda (intenzitet) svetlosnog zraka redukovana prilikom njegovog prolaska kroz objekat (difrakovani zraci) • fazni objekti-transparentni, prilikom prolaska svetlosnog zraka kroz objekat ne dolazi do promene amplitude i faze (direktni zraci)

18. Amplitudni i fazni objekti

19. Mikroskop sa faznim kontrastom • kondenzator sa prstenastom dijafragmom pozicioniranom izmedju izvora svetlosti i sočiva kondenzatora • svetlost prolazi kroz prstenasti otvor dijafragme, krug svetlosti prolazi kroz kondenzor i objekat i dolazi u objektiv • objektiv ima fazni prsten (menja fazu svetlosti za 1/4 λ) • svetlost koja prolazi kroz ćeliju prelazi duži put (veći indeks prelamanja), stiže u okular u različitoj fazi prema zraku koji ne prolazi kroz objekat, interferencija daje lik

21. Razlika izmedju preparata posmatranog svetlosnim i mikroskopom sa faznim kontrastom

22. Fluorescentni mikroskop • kao izvor svetlosti koriste se živine lampe • kondenzor sa tamnim poljem • tri seta filtera kroz koje prolazi svetlost pre nego što stigne do oka • molekul posmatranog objekta apsorbuje energiju elektromagnetnog talasa (svetlosni zrak), dolazi do njegove ekscitacije, emisijom svetlosti molekul se vraća u prvobitno nepobudjeno stanje, a pojava se naziva florescencija • tehnika podrazumeva primenu florohroma, supstanci kojima se tretiraju objekti, kako bi postojala mogućnost florescencije

24. Fluorescentni mikroskop

25. Elektronski mikroskop • umesto svetlosnih zraka primenjuje se snop elektrona • moć razdvajanja nije ograničena λ (10000 puta kraća nego u slučaju zraka svetlosti) • umesto sistema sočiva koristi se sistem elektromagneta • neophodan je sistem za održavanje vakuuma u kome se elektronski zrak kreće • Osnovni tipovi el. mikroskopa: • skening elektronski-3D slika, pretražujući, manje uvećanje, elektroni se odbijaju od objekta • transmisioni-2D slika, e¯ prolaze kroz objekat

26. Skening elektronski mikroskop

27. Transmisioni elektronski mikroskop

30. Merenje dimenzije posmatranog objekta

31. Merenje dimenzije posmatranog objekta okular-mikrometar objektiv-miktometar

32. Merenje dimenzije posmatranog objekta