第七章

1. 第七章 细菌对抗菌药物敏感性的检验

2. 学习目标:

3. 现状： 在应用抗菌药物治疗过程中,细菌对药物的敏感性会发生改变.近年来,随着抗菌药物的广泛应用,更因为广谱和超广谱抗菌药物的滥用,造成耐药菌株数迅速增加,耐药范围不断扩大,导致抗菌治疗效果严重下降,耐药菌引起的内源性感染和医院交叉感染也日益增多。因此，必须加强细菌对抗菌药物的的实验室检测，从而及时准确地监测细菌对药物的敏感性和耐药性改变。

4. 临床微生物实验室做药敏试验的目的： 一是指导临床医师选择最佳抗菌药物进行治疗； 二是在一定区域内进行耐药性变迁的微生物流行病学调查，以宏观控制耐药性、院内感染的发生发展。

5. 一、概念 • 根据常规剂量的待测药物在体内所能达到的浓度对细菌的影响，可将被检菌株对待测药物的敏感程度分为敏感、中度敏感/中介度、耐药三级。

6. 敏感（S）:表示被检菌可被常规剂量的待测药物在体内达到的浓度所抑制或杀灭。敏感（S）:表示被检菌可被常规剂量的待测药物在体内达到的浓度所抑制或杀灭。 • 耐药(R):表示被检菌不能被常规剂量待测药物所达到的浓度所抑制。 • 中度敏感(MS):表示被检菌可被待测药物大剂量给药所达到的浓度所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。 • 中介度(I):是为防止因技术因素失控导致结果误差而设置的"缓冲域"

7. 最小抑菌浓度(MIC):抗菌药物能抑制被检菌生长的最低浓度。最小抑菌浓度(MIC):抗菌药物能抑制被检菌生长的最低浓度。 对同一菌株而言，药物的MIC值越小，其抗菌力就越强，细菌对这种药物就越敏感。 • 最低杀菌浓度(MBC):抗菌药物完全杀灭细菌所需要的最低浓度。

8. 二、药敏试验的临床意义 • 1.筛选药物 • 2.耐药监控 • 3.评价新药 • 4.鉴定细菌

9. 三、药敏试验的常用方法 1、 纸片扩散法 2、稀释法 稀释法包括宏量肉汤稀释法(macrodilution test)、微量肉汤稀释法(microdilution test)、琼脂稀释法(agar dilution test)。 3、E-test法

10. 1.扩散法 • 1)方法：是将含有定量抗菌药物纸片(药敏纸片)贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌在一定距离内的生长受到抑制，形成抑菌圈，再测量抑菌圈的直径来判定待检菌对被测药物的敏感程度。 • 2）其优点：是方法简单易行、价格便宜、药物选择性灵活，适用对生长快的细菌进行药敏试验。 • 3）缺点：是该方法操作时影响因素较多，需注意控制。

12. 2．稀释法 • 方法：即用肉汤或琼脂培养基作为稀释剂，倍比稀释抗菌药物，定量加入被检菌株。经培养后观察抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。临床工作中常根据抗菌药物在体内的治疗浓度与该药体外最低抑菌浓度(MIC)之间的关系来判断细菌对该药的敏感程度。 • 优点是可直接定量地检测抗菌药物在体外对病原菌的抑制或杀伤浓度，有利于临床根据MIC、药物代谢等拟定合理的治疗方案，也是目前厌氧菌等的最佳测定方法。 • 缺点是操作比较烦琐，不便于基层实验室中开展。

13. 4 2 1 0.5 0.25 0.12 0 mg/ml 细菌药敏试验-宏量稀释法

14. 微量液体稀释法

15. 3.E-test法 • 方法：是结合了扩散法和稀释法的原理和特点，操作时用宽5mm、长5Omm的塑料试条与抗菌药物浓度梯度试条粘合，贴在涂有细菌的琼脂板上。抗菌药物在琼脂内向四周扩散，可使敏感细菌在一定范围内的生长受到抑制，形成抑菌圈。可根据药敏试纸条两侧抑菌圈与试条相交位置的刻度数值，准确、定量地测出抗菌药物对被检菌的最低抑菌浓度(MIC)。 • 特点：同时具有扩散法和稀释法的优势，操作简单、定量检测、结果直观准确、重复性好，可获得与稀释法相同的效果，且较稀释法读出不连续值更为准确。可广泛应用于许多微生物的药敏试验。对各种耐药表型如中低度耐药株、延迟表达耐药的菌株均可获得良好的效果。

16. 细菌药敏试验- E-test法 • E-test • Strips containing a gradient of antibiotic are placed on lawn of bacteria and incubated overnight. MIC is determined at point where zone of inhibition intersects scale on strip. • Combines ease of KB with an MIC method. Particularly useful for S. pneumoniae.

17. 4、联合药敏试验 • 方法：一般应用两种抗菌药物同时对被检菌进行扩散法或稀释法药敏试验，根据抑制圈的形态变化，可判断两种药物是否具有协同、累加无关或拮抗作用。以检测两种抗菌药物之间的药效相关性。 • 特点是可预期任何两种抗菌药物联合用药的治疗效果，指导临床选择最佳治疗方案。在提高疗效，减少用药剂量，降低毒性反应，防止或延缓耐药菌株的产生等方面有重要意义。 • 应用：主要用于各种严重感染、多重感染、耐药菌株感染或慢性感染等情况下的药敏试验。

18. (二)药敏试验的常见类型 • 见书P66表7-1

19. 四、抗菌药物的选择原则 • 抗菌药物的选择应在熟悉和掌握常用抗菌药物的药理学特征和临床常见病原菌的生物学、致病性特征的基础上，结合本单位抗感染治疗的实际和本地区细菌耐药性及敏感谱的变化情况，选择药物。一般选择有代表性的药物做药敏试验，分首选、次选等层次，首选药是针对不同种类病原菌的最佳选择，次选药只在病原菌对首选药物不敏感或病人对首选药过敏的情况下选用

20. 第二节 K-B法

21. 一、原理 • 将含有定量抗菌药物的纸片贴在己接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后借其分子扩散力不断向周围区域扩散，随着距离的增加形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内被检菌的生长受抑制，形成无菌透明的抑菌圈。抑菌圈直径的大小与药物的最低抑菌浓度(MIC)呈负相关关系。即抑菌圈愈大，MIC值愈小，则细菌对药物的敏感程度愈大。

23. 二、实验材料 • 1．药敏纸片 • 2．培养基 • 3．菌液 • 1)药敏试验标准比浊管的制备:0.048m0l/L(1.175%)氯化钡0.5m1加0.18m0l/L(1%)硫酸溶液99.5ml充分混匀，其浊度为0.5麦氏比浊标准，分装试管，置室温下暗处保存。使用前应充分混匀，每半年重配一次。 • 2)被检菌液的制备:用接种环挑取已分纯的被检菌菌落4-5个，接种于3-5mlMH肉汤，35C培养4小时。链球菌属和嗜血杆菌属需在5%羊血MH肉汤中培养过夜，淋病奈瑟菌需在5%-7%C02条件下培养。用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准，校正后的菌液应在15分钟内接种。

24. 三、操作方法 • 用无菌棉拭蘸取制备好的菌液，在管内壁挤去多余菌液均匀涂布接种于琼脂表面，一般涂布3次，每次平板旋转60度，最后沿平板内沿涂抹一周，置室温干燥3-5分钟后，用无菌镊子或贴纸机将药敏纸片紧贴于含菌琼脂表面。纸片位置要适当，各纸片中心距离不小于24mm，纸片距平皿内缘应大于l5mm。直径9Omm的平皿可贴6张纸片，贴后要尽量避免移动，置于35C培养16-18小时观察记录结果。

25. 1.MH平板的厚度要求4mm

26. 2.菌液浓度0.5麦氏单位,无菌棉签蘸取菌液.

27. 3.均匀涂布.

28. 4.贴纸片,毕,轻轻按压,

29. 5.也可以用纸片分配器贴纸片;

30. 6.用游标卡尺量取直径.(如何读游标卡尺,请参见本坛bjyy老师前面发过的贴图)6.用游标卡尺量取直径.(如何读游标卡尺,请参见本坛bjyy老师前面发过的贴图)

31. 7.根据最新CLSI/NCCLS标准指南判断出:S或I或R.

32. 四、结果判断 • 一般宜在黑色无反光背景上观察，如培养基含有血液须打开皿盖观察，测量抑菌圈直径(单位为mm)，判断结果。每批试验部应做标准菌株对照，只有对照菌株的敏感度符合标准，实验结果才可靠。

33. 五、影响因素 • 1、培养基 培养基的成分、含量、pH值、琼脂的厚度、硬度和表面湿度等，都可影响抑菌圈大小 • 2、药敏纸片 纸片含药量是影响药敏试验结果的主要因素。纸片含药量直接影响抑菌环的大小，与纸片的重量、吸水性、直径有关。纸片保存条件以低温干燥为佳。 • 

34. 3、菌量 待检菌液的浓度、接种量，取决于麦氏比浊标准管的配制、保存和正确使用4、操作方法 • 5、培养条件、温度和时间控制 • 6、抑菌环测量工具的精度及测量方法 • 7、质控标准菌株本身的药敏特性是否合格 • 

35. 谢谢！