Elettrofisiologia cellulare

1. Elettrofisiologia cellulare Proprietà delle membrane e meccanismi di trasporto

2. Struttura e funzioni della membrana cellulare La membrana cellulare ha diverse funzioni: • racchiude la cellula e la delimita definendone i confini • mantiene la separazione fra citosol e ambiente extracellulare • media e seleziona il trasporto di determinate sostanze impedendo ingresso e uscita di altre

3. Le membrane hanno struttura simile a doppio strato con due costituenti principali che sono: Proteine: intriseche ed estrinseche Lipidi: i più abbondanti sono i fosfolipidi che sono molecole anfipatiche con una porzione idrofilica (testa) ed una porzione idrofobica (coda). Altri lipidi abbondanti in membrana sono: glicolipidi e colesterolo

4. Struttura della membrana cellulare con fosfolipidi (in viola) e proteine intrinseche (in azzurro) ed estrinseche (in verde) Struttura di un fosfolipide

6. Meccanismi di trasporto La membrana cellulare è in grado di permettere il passaggio di sostanze in modo selettivo grazie a meccanismi di trasporto. Ricordiamo che il doppio strato lipidico costituisce una barriera al passaggio di tutte le molecole polari cariche, mentre permette il passaggio di piccole molecole polari prive di carica. Le sostanze idrofobiche passano invece bene il doppio strato senza causare problemi (O2, CO2, N2).

7. Esistono meccanismi di trasporto che avvengono senza attraversamento della membrana cellulare come: • Fagocitosi(materiale particolato; vedi macrofagi) • Pinocitosi(molecole solubili; endocitosi costitutiva) • Endocitosi (materiale inglobato in seguito ad interazione con recettori; per assunzione di ormoni, fattori di crescita) • Esocitosi(verso l’esterno. Secrezione di neurotrasmettitori, zimogeni pancreatici etc.)

8. pinocitosi fagocitosi endocitosi esocitosi

9. Esistono meccanismi di trasporto che prevedono attraversamento della membrana cellulare. Fra questi ricordiamo: • Diffusione semplice: regolata dalla legge di Fick J=-DA dc/dx • Diffusione facilitata(elevata specificità chimica delle proteine trasportatrici) • Trasporto attivo(primario e secondario)

11. Avviene lungo un gradiente di concentrazione e non richiede energia. È un processo che continua fino a quando esiste una differenza di concentrazione. Un altro tipo di diffusione passiva è il trasporto facilitato. Esso avviene sempre lungo un gradiente di concentrazione, ma necessita di proteine carrier a cui le sostanze trasportate si legano.

14. La differenza principale è che, mentre la diffusione passiva continua fino a quando esiste un gradiente, il trasporto facilitato ha una saturazione che dipende dal numero di trasportatori utilizzato

15. Il trasporto attivo entra in gioco tutte le volte che le sostanze sono mosse contro un gradiente di concentrazione. Questo tipo di trasporto implica un dispendio energetico che viene fornito dal consumo di ATP. Per questo tipo di trasporto vale l’equazione di Michaelis- Menten: V=Vmax· [S] / (Km + [S])

16. Un esempio tipico di trasporto attivo è la pompa Na-K ATPasi che sposta 3 ioni Na+ verso l’esterno e 2 ioni K+ verso l’interno contribuendo alla negatività della membrana cellulare (pompa elettrogenica). È fosforilata durante il suo ciclo di attività e quindi è indicata come ATPasi di tipo P. È inibita dall’ouabaina che compete per il sito del potassio. Risulta costituita da due subunità: Subunità α detta catalitica di circa 100 kDa Subunità β glicoproteica di circa 50kDa.

19. Caratteristiche generali degli equilibri ionici

20. Na+ Na+ in out - + Solo gradiente chimico Gradiente chimico e gradiente elettrico Na+ Na+ in out La grandezza che tiene conto di entrambi i gradienti è il potenziale di equilibrio elettrochimico definito come:

21. μ = μ0 + RTlnC + zFE Dove: μ0= potenziale elettrochimico standard C= concentrazione dello ione z= valenza dello ione F= costante di Faraday E= potenziale elettrico Il flusso netto dello ione è diretto dalla zona a potenziale chimico maggiore alla zona a potenziale chimico minore. Quindi vale: Δμx = μA (x) – μB (x) XA XB

22. Quindi se: Δμ > 0 lo ione X si muove dal compartimento A a quello B Δμ < 0 lo ione X si muove dal compartimento B a quello A Δμ = 0 non c’è flusso netto dello ione X. Da questo assunto si ricava la legge di Nernst valida per una qualunque specie ionica in equilibrio fra ambiente extra- ed ambiente intra-cellulare. In equilibrio vale Δμ = 0e quindi se μA = μB si ha: RT ln XA / XB + zF (EA – EB) = 0 ΔE = RT / ZF Log (XB / XA)

23. Potenziale di Nernst per Na+ e K+

25. Alla fine del 19esimo secolo si sapeva che il citoplasma cellulare è ricco di ioni K+ e che il Na+ è poco concentrato e che questa situazione è opposta nell’ambiente extracellulare. La prima assunzione fatta è stata quella di considerare la membrana permeabile al potassio, ma non al sodio e calcolare quindi il potenziale di riposo trans-membrana come un potenziale di Nernst per il potassio. In realtà la membrana è permeabile al Cl- tanto quanto al potassio e questi due ioni sono fra loro in equilibrio secondo un equilibrio di Donnan che afferma: [K+]out· [Cl-]out = [K+]in· [Cl-]in Ogni volta che due ioni possono attraversare la membrana cellulare, il prodotto delle loro concentrazioni extracellulari è uguale al prodotto delle concentrazioni intracellulari

26. Potenziale di riposo della membrana cellulare Una differenza di carica elettrica fra interno ed esterno della superficie della membrana è detta potenziale elettrico. Tutte le cellule animali e vegetali sono caratterizzate da un potenziale di membrana di riposo (resting potential) che dipende dal movimento di tutti gli ioni permeabili attraverso la membrana cellulare. Il valore del potenziale di riposo è variabile fra cellula e cellula, ma approssima il potenziale di Nernst dello ione potassio. Vediamo perché. Quando una o più specie ioniche si distribuiscono sui due lati della membrana cellulare, ciascuna tenderà a spostare il valore del potenziale al valore del suo potenziale di equilibrio elettrochimico.

27. Tanto più la membrana è permeabile ad una specie ionica, tanto maggiore sarà la forza che tale specie ionica eserciterà nello spostare il valore del potenziale. • In una membrana permeabile a più ioni il potenziale trans-membrana dipende da: • Carica elettrica di ciascuno ione • Permeabilità della membrana a ciascuno ione • Concentrazione interna ed esterna della specie ionica

28. La formula che meglio descrive il potenziale di riposo di una membrana cellulare è l’equazione di Goldman che considera non soltanto le concentrazioni ioniche delle specie in gioco, ma anche la permeabilità della membrana.

29. Poiché variazioni delle concentrazioni di cloro non modificano in maniera significativa il potenziale di membrana, il fattore cloro può essere escluso dall’equazione di Goldman. L’equazione finale considera quindi soltanto le specie ioniche Na+ e K+. In questo modo si ottiene un valore teorico che è molto simile al valore che può essere sperimentalmente misurato. Inoltre, essendo la permeabilità al sodio molto inferiore a quella del potassio (circa 1:100), il potenziale di riposo di un membrana cellulare è molto simile al potenziale di equilibrio elettrochimico per lo ione potassio.

31. Il fatto che, anche se in piccola percentuale, la membrana a riposo sia permeabile anche al Na+, fa sì che il potenziale di riposo non sia esattamente il potenziale di Nernst del potassio, ma sia un po’ meno negativo. Questo dipende dal fatto che il Na+ tende a spostare il potenziale verso il suo potenziale di equilibrio elettrochimico (potenziale di Nernst). Vresting=-70 / -80mV EK=-90mV

32. The membrane potential of a cell can be measured in millivolts (mV) with the use of a microelectrode and an oscilloscope.(a) Both recording (needle) and reference (block) electrodes are outside of the cell, and no electrical potential (0 mV) is recorded. (b) The recording electrode is inside the cell, the reference electrode is outside, and an electrical potential difference of about 85 mV is recorded, with the inside of the plasma membrane negative with respect to the outside of the plasma membrane.

33. IMPORTANTE !!!!!!! Consideriamo adesso i fatti visti. Affinché il potenziale di riposo si mantenga dobbiamo mantenere le differenze di concentrazione fra le specie ioniche considerate fra ambiente intra- e extra-cellulare. Per fare questo dobbiamo quindi mantenere i gradienti di concentrazione controbilanciando il movimento passivo degli ioni Na+ verso l’interno della cellula e degli ioni K+ verso l’esterno della cellula. Questo è fatto dalla pompa Na-K ATPasi che mantiene i gradienti ionici spostando ioni sodio e ioni potassio con dispendio di energia. In questo modo il potenziale di riposo può essere mantenuto.

34. mV ENa+ +61mV 0mV Vresting -80mV EK+ -90mV

35. Risposte elettriche delle membrane cellulari

36. Tutte le cellule viventi, animali e vegetali sono caratterizzate da variazioni del potenziale di riposo se opportunamente stimolate. Esistono due tipi di risposta: • Risposta elettrica passiva o potenziale elettrotonico: si produce TUTTE le volte che si fa passare corrente attraverso una membrana cellulare. Questo accade perché la membrana cellulare è caratterizzata da proprietà elettriche di cui adesso parleremo e che sono: • capacità • resistenza

37. Risposta attiva o potenziale d’azione o spike: è presente nelle cosiddette cellule eccitabili, vale a dire neuroni, cellule muscolari e cellule secretorie (ad esempio le cromaffini del surrene). Utilizza strutture particolari e cioè canali di membrana e in particolare canali del Na+ e canali del K+. Questa risposta può esserci o non esserci e vedremo quali sono le condizioni. N.B. La risposta elettrotonica compare sempre, indipendentemente dall’attivazione di canali

38. Potenziale elettrotonico

39. La membrana cellulare è formata da un doppio strato lipidico in cui sono inserite proteine che hanno la funzione di trasportare materiale attraverso la membrana. Il doppio strato lipidico, dal punto di vista elettrico si comporta come un condensatore, cioè ha la capacità di separare le cariche sui due lati della membrana. Le due piastre conduttrici sono rappresentate dal mezzo intracellulare e da quello extracellulare. Il dielettrico isolante è rappresentato dal doppio strato lipidico.

40. Si definisce capacità la seguente grandezza: C= ε A / d dove ε è la costante dielettrica del mezzo, A è l’area della membrana e d è la distanza fra le piastre cioè lo spessore della membrana. Per le membrane cellulari si preferisce parlare di capacità specifica in modo da evitare il fattore area. Questa si definisce come Cm= C /A da cui si ottiene: Cm= ε / d Per le membrane cellulari dove A=25Å si ha un valore di Cm=1μF/cm2

41. Nella membrana cellulare si trovano anche proteine canale che permettono il passaggio di ioni. Queste strutture sono responsabili della seconda caratteristica della membrana cellulare, cioè della conduttanza (1/R). Questa grandezza è la seconda componente del circuito elettrico equivalente della membrana cellulare.

42. A questo punto dobbiamo includere nell’equivalente elettrico della membrana il potenziale di membrana. Questo esiste sempre grazie alla ridistribuzione degli ioni determinata dai gradienti elettrici e chimici. A riposo questo potenziale è detto resting potential e si rappresenta come una batteria.

43. Equivalente elettrico della membrana cellulare Sulla base di questo possiamo vedere come risponde una membrana cellulare opportunamente stimolata e perché la risposta passiva compare sempre.

45. Il circuito equivalente deve tenere conto di tutte le conduttanze ioniche presenti e quindi di tutte le batterie dei diversi sistemi ionici e del corrispondente potenziale di inversione. Il risultato è il seguente.

46. OUTSIDE INSIDE

48. Quindi una membrana con queste caratteristiche se viene stimolata in modo opportuno, come per esempio da un passaggio di corrente risponde con una variazione del potenziale in modo proporzionale al valore di resistenza e capacità. Questa variazione di potenziale prende il nome di potenziale elettrotonico. Quando la corrente è iniettata essa comincia a fluire attraverso la capacità che tende a caricarsi. La fase di crescita del potenziale è data da: V= iR (1-e –t/τ) dove τ=RC. Quando t=RC allora Vt=63%V0.

49. RC si definisce costante tempo della membrana. Quando sono trascorse diverse costanti tempo, il potenziale approssima un asintoto e tutta la corrente fluisce attraverso la resistenza (Ic=0 perché Ic=dQ/dt=CdV/dt) con un valore che sarà proporzionale alla legge di Ohm V=IrR.

50. Le caratteristiche del potenziale elettrotonico sono: • È sempre presente, in tutti i tipi cellulari se interviene uno stimolo sulla membrana cellulare • Dipende dalle caratteristiche passive della membrana cellulare, cioè resistenza e capacità • Non coinvolge attività di canali • È proporzionale all’intensità dello stimolo che lo genera, è cioè un segnale di tipo analogico • Decade nel tempo e nello spazio con una costante di spazio che dipende dalle caratteristiche della fibra