第 31 讲 第十章 吸光光度法 第 2 讲

1. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 第四节 吸光光度法分析条件的选择 • 一、显色反应及其条件的选择 • （一）显色反应和显色剂 • 1.显色反应 • 在分光光度分析中，将试样中被测组分转变成有色化合物的反应叫显色反应。显色反应可分两大类，即络合反应和氧化还原反应，而络合反应是最主要的显色反应。与被测组分化合成有色物质的试剂称为显色剂。同一组分常可与若干种显色剂反应，生成若干有色化合物，其原理和灵敏度亦有差别。一种被测组分究竞应该用哪种显色反应，可根据所需标准加以选择。

2. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 选择显色反应的一般标准: • (1) 选择性要好。一种显色剂最好只与一种被测组分起显色反应，这样干扰就少。或者干扰离子容易被消除、或者显色剂与被测组分和干扰离子生成的有色化合物的吸收峰相隔较远。 • (2)灵敏度要高。由于吸光光度法一般是测定微量组分的，灵敏度高的显色反应有利于微量组分酌测定。灵敏度的高低可从摩尔吸光系数值的大小来判断，κ值大灵敏度高，否则灵敏度低。但应注意，灵敏度高的显色反应，并不一定选择性就好，对于高含量的组分不一定要选用灵敏度高的显色反应。 • (3)对比度要大。即如果显色剂有颜色，则有色化合物与显色剂的最大吸收波长的差别要大，一般要求在60nm以上。

3. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • (4)有色化合物的组成要恒定,化学性质要稳定。有色化合物的组成若不确定，测定的再现性就较差。有色化合物若易受空气的氧化、日光的照射而分解，就会引入测量误差。 • (5)显色反应的条件要易于控制。如果条件要求过于严格，难以控制，测定结果的再现性就差。

4. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 2.显色剂 • (1)无机显色剂 • 许多无机试剂能与金属离子起显色反应，如Cu2+与氨水形成深蓝色的络离子Cu(NH4)42+，SCN-与Fe3+形成红色的络合物Fe(SCN)2+或Fe(SCN)63-等。但是多数无机显色剂的灵敏度和选择性都不高，其中性能较好，目前还有实用价值的有硫氰酸盐、钼酸铵、氨水和过氧化氢等。 • (2)有机显色剂 • 许多有机试剂，在一定条件下，能与金属离子生成有色的金属螯合物(具有环状结构的络合物)。

5. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 将金属螯合物应用于光度分析中的优点是： 1．大部分金属螯合物都呈现鲜明的颜色，摩尔吸光系数大于104，因而测定的灵敏度很高； 2．金属螯合物都很稳定，一般离解常数都很小，而且能抗辐射； 3．专用性强，绝大多数有机整合剂，在一定条件下，只与少数或其一种金属离子络合，而且同一种有机螯合剂与不同的金属离子络合时，生成具有特征颜色的螯合物

6. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 4．虽然大部分金属螯合物难溶于水，但可被萃取到有机溶剂中，大大发展了萃取光度法。 5．在显色分子中，金属所占的比率很低，提高了测定的灵敏度。因此，有机显色剂是光度分析中应用最多最广的显色剂，寻找高选择性、高灵敏度的有机显色剂，是光度分析发展和研究的重要内容。

7. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 在有机化合物分子中，凡是包含有共轭双键的基团如—N＝N—、—N＝O、—NO2、对醌基、＝C＝O(羰基)、＝C＝S(硫羰基)等，一般都具有颜色，原因是这些基团中的л电子被光激发时，只需要较小的能量，能吸收波长大于200nm的光，因此，称这些基团为生色团；某些含有未共用电子对的基团如胺基—NH2，RHN—，R2N—(具有一对未共用电子对)，羟基-OH(具有两对末共用电子对)，以及卤代基—F，—Cl，—Br，—I等，它们与生色基团上的不饱和键互相作用，引起永久性的电荷移动，从而减小了分子的活化能促使试剂对光的最大吸收“红移”(向长波方向移动)，使试剂颜色加深，这些基团称为助色团。

8. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 含有生色基团的有机化合物常常能与许多全属离子化合生成性质稳定且具有特征颜色的化合物，且灵敏度和选择性都很高，这就为用光度法测定这些离子提供了很好的条件。 • 有机显色剂的种类很多，下面仅将应用较广泛的几种介绍如下： • 1.邻二氮菲 • 2.双硫腙 • 3. 二甲酚橙 • 4. 偶氮胂III • 5．铬天青S

9. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • （二）显色反应条件的选择 • 显色反应能否完全满足光度法的要求，除了与显色剂的性质有主要关系外，控制好显色反应的条件也是十分重要的，如果显色条件不合适，将会影响分析结果的准确度。 • 1.显色剂的用量 • 显色就是将被测组分转变成有色化合物，表示： • M + R = MR • (被测组分) (显色剂) (有色化合物) • 反应在一定程度上是可逆的。为了减少反应的可逆性，根据同离子效应，加入过量的显色剂是必要的，但也不能过量太多，否则会引起副反应，对测定反而不利。

10. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 2.溶液的酸度 • 溶液酸度对显色反应的影响很大，这是由于溶液的酸度直接影响着金属离子和显色剂的存在形式以及有色络合物的组成和稳定性。因此，控制溶液适宜的酸度，是保证光度分析获得良好结果的重要条件之一。 • (1)酸度对被测物质存在状态的影响 • 大部分高价金属离子都容易水解，当溶液的酸度降低时，会产生一系列羟基络离子或多核羟基络离子。高价金属离子的水解象多元弱酸的电离一样，是分级进行的。 • 随着水解的进行，同时还发生各种类型的聚合反应。聚合度随着时间增大，而最终将导致沉淀的生成。显然，金属离子的水解，对于显色反应的进行是不利的，故溶液的酸度不能太低。

11. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • (2) 酸度对显色剂浓度和颜色的影响 • 光度分析中所用的大部分显色剂都是有机弱酸。显色反应进行时，首先是有机弱酸发生离解，其次才是络阴离子与金属离子络合。 • M + HR＝MR + H+ • 从反应式可以看出，溶液的酸度影响着显色剂的离解,并影响着显色反应的完全程度。当然，溶液酸度对显色剂离解程度影响的大小，也与显色剂的离解常数有关，Ka大时，允许的酸度可大；Ka很小时，允许的酸度就要小些。

12. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 许多显色剂本身就是酸碱指示剂，当溶液酸度改变时，显色剂本身就有颜色变化。如果显色剂在某一酸度时，络合反应和指示剂反应同时发生，两种颜色同时存在，就无法进行光度测定。例如、二甲酚橙在溶液的pH＞6.3时呈红色，在pH＜6.3时呈柠檬黄色，在pH＝6.3时，呈中间色，故pH＝6.3时,是它的变色点。而二甲酚橙与金属离子的络合物却呈现红色。因此，二甲酚橙只有在pH＜6的酸性溶液中可作为金属离子的显色剂。如果在pH＞6的酸度下进行光度测定，就会引入很大误差。

13. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • (3)对络合物组成和颜色的影响 • 对于某些逐级形成络合物的显色反应、在不同的酸度时，生成不同络合比的络合物。例如铁与水杨酸的络合反应，当 • pH＜4 [Fe3+(C7H4O3)2-]+紫色 • 4＜pH＜9 [Fe3+(C7H4O3)22-]-红色 • pH＞9 [Fe3+(C7H4O3)32-]3-黄色 • 在这种情况下，必须控制合适的酸度，才可获得好的分析结果。

14. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 3.时间和温度 • 显色反应的速度有快有慢。显色反应速度，几乎是瞬间即可完成，显色很快达到稳定状态，并且能保持较长时间。大多数显色反应速度较慢，需要一定时间，溶液的颜色才能达到稳定程度。有些有色化合物放置一段时间后，由于空气的氧化，试剂的分解或挥发，光的照射等原因，使颜色减退。适宜的显色时间和有色溶液稳定程度，也必须通过实验来确定。实验方法是配制一份显色溶液，从加入显色剂计算时间、每隔几分钟测定一次吸光度，绘制A-t曲线，根据曲线来确定适宜的时间。

15. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 不同的显色反应需要不同的温度，一般显色反应可在室温下完成。但是有些显色反应需要加热至一定的温度才能完成；也有些有色络合物在较高温度下容易分解。因此，应根据不同的情况选择适当的温度进行显色。温度对光的吸收及颜色的深浅也有一定的影响，故标样和试样的显色温度应保持一样。合适显色温度也必须通过实验确定,做A-c曲线即可求出。 • 4.有机溶剂和表面活性剂 • 溶剂对显色反应的影响表现在下列几方面。

16. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • （1）溶剂影响络合物的离解度 许多有色化合物在水中的离解度大，而在有机溶剂中的离解度小，如在Fe(SCN)3溶液中加入可与水混溶的有机试剂(如丙酮)，由于降低了Fe(SCN)3的离解度而使颜色加深提高了测定的灵酸度。 • （2）溶剂改变络合物颜色的原因可能是各种溶剂分子的极性不同、介电常数不同，从而影响到络合物的稳定性，改变了络合物分子内部的状态或者形成不同的溶剂化物的结果。 • （3）溶剂影响显色反应的速度 例如，当用氯代磺酚S测定Nb时，在水溶液中显色需几小时，如果加入丙酮后,仅需30分钟。 • 表面活性剂的加入可以提高显色反应的灵敏度，增加有色化合物的稳定性。其作用原理一方面是胶束增溶，另一方面是可形成含有表面活性剂的多元络合物。

17. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 5.共存离子的干扰及消除 • 共存离子存在时对光度测定的影响有以下几种类型： • (1) 与试剂生成有色络合物。如用硅钼蓝光度法测定钢中硅时，磷也能与钼酸铵生成络合物，同时被还原为钼蓝，使结果偏高。 • (2)干扰离子本身有颜色。如Co2+(红色)、Cr3+(绿色)、Cu2+(蓝色)。 • (3)与试剂结合成无色络合物消耗大量试剂而使被测离子络合不完全。如用水扬酸测Fe3+时，Al3+、Cu2+等有影响。 • (4)与被测离子结合成离解度小的另一化合物。如由于F-的存在，能与Fe3+以FeF63-形式存在，Fe(SCN)3本不会生成，因而无法进行测定。

18. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 消除干扰的方法主要有以下三种： • （1）控制酸度 • 控制显色溶液的酸度，是消除干扰的简便而重要的方法。许多显色剂是有机弱酸，控制溶液的酸度，就可以控制显色剂R的浓度，这样就可以使某种金属离子显色，使另外一些金属离子不能生成有色络合物。 • 当溶液的情况比较复杂，或各种常数值不知道队则溶液最适合的pH值须通过实验方法来确定。

19. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • （2）加入掩蔽剂 • 在显色溶液里加一种能与干扰离子反应生成无色络合物的试剂，也是消除干扰的有效而常用的方法。例如用硫氰酸盐作显色剂测定Co2+，Fe3+有干优可加入氟化物，使Fe3+与F-结合生成无色而稳定的FeF63-，就可以消除干扰。 • 在另外的情况下，也可通过氧化—还原反应，改变干扰离子的价态以消除于扰。 • （3）采用萃取光度法 用适当的有机溶剂萃取有色组分,如用丁二酮肟测定钯时，钯与丁二酮肟所形成的内络盐，可被氯仿从酸性溶液中选择性地萃取。许多干扰离子则不被萃取。

20. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • （4）在不同波长下测定两种显色配合物的吸光度,对它们进行同时测定。 • （5）寻找新的显色反应 • 如将二元配合物改变为三元配合物。 • （6） 分离干扰离子 • 在没有适当掩蔽剂时，干扰离于可用电解法，淀法或离子交换法等分离除去。 • 此外，还可以通过选择适当的测量条件，消除干扰离子的影响。

21. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择 • 光度分析法的误差来源有两方面，一方面是各种化学因素所引入的误差，另一方面是仪器精度不够，测量不准所引入的误差。 • （一）仪器测量误差 • 任何光度计都有一定的测量误差。仪器测量误差主要是指光源的发光强度不稳定，光电效应的非线性，电位计的非线性、杂散光的影响、滤光片或单色器的质量差(谱带过宽)，比色皿的透光率不一致，透光率与吸光度的标尺不准等因素。对给定的光度计来说，透光率或吸光度的读数的准确度是仪器精度的主要指标之一，也是衡量测定结果准确度的重要因素。

22. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 光度计主要仪器测量误差是表头透射比的读数误差。光度计的读数标尺上透射比T的刻度是均匀的，故透射比的读数误差ΔT（绝对误差）与T本身的大小无关，对于一台给定仪器它基本上是常数，一般大0.002-0.01之间，仅与仪器身身的精度有关。

23. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • （二）测量条件的选择 • 选择适当的测量条件，是获得准确测定结果的重要途径。择适合的测量条件，可从下列几个方面考虑。 • 1.测量波长的选择 • 由于有色物质对光有选择性吸收，为了使测定结果有较高的灵镀度和准确度，必须选择溶液最大吸收波长的入射光。如果有干扰时，则选用灵敏度较低但能避兔干扰的入射光，就能获得满意的测定结果。

24. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 2.吸光度范围的控制 • 吸光度在0.15-0.80时，测量的准确度较高。为此可以从下列几方面想办法： • （1）计算而且控制试样的称出量，含量高时，少取样，或稀释试液；含量低时，可多取样，或萃取富集。 • （2）如果溶液已显色，则可通过改变比色皿的厚度来调节吸光度大小。

25. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 3.参比溶液的选择 • 参比溶液是用来调节仪器工作零点的，若参比溶液选得不适当，则对测量读数准确度的影响较大。选择的办法是： • （1）当试液、试剂、显色剂均无色时，可用蒸馏水作参比液。 • （2）试剂和显色剂均无色时，而样品溶液中其他离子有色时，应采用不加显色剂的样品溶液作参比液。 • （3）试剂和显色剂均有颜色时，可将一份试液加入适当掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，然后把显色剂、试剂均按操作手续加入，以此做参比溶液，这样可以消除一些共存组分的干扰。

26. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 此外，对于比色皿的厚度、透光率、仪器波长，读数刻度等应进行校正，对比色皿放置位置、光电池的灵敏度等也应注意检查。 • 第五节 吸光光度法的应用 • 吸光光度法除了广泛地用于测定微量成分外，也能用于常量组分及多组分的测定。同时，还可以用于研究化学平衡、络合物组成的测定等。下面简要地介绍有关这些方面的应用。 • 一、定量分析 • （一）单组分的测定

27. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 1.一般方法 • A-c标准曲线法 • 2.示差法 • 当被测组分含量高时，常常偏离朗伯-比耳定律。即使不偏离，由于吸光度太大，也超出了准确读数的范围，就是把分析误差控制在5%以下，对高含量成分也是不符合要求的。如果采用示差法，就能克服这一缺点，也能使测定误差降到±0.5％以下。 • 示差法与普通光度法的主要区别在于它采用的参比溶液不同，它不是以c=0的试剂空白作参比，而是以一个浓度比试液cx稍小的标准溶液cs作参比，然后再测定试液的吸光度。

28. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • As=-lgTs=κbcsAx=-lgTx=κbcx • 实际测得吸光度Af为 • Af=Ax-As=κb(cx-cs)=κbΔc • cx=cs+Δc • 示差法相对普通光度法提高测量准确度的原因是扩展了读数标尺。 • 从仪器构造上讲，示差光度法需要一个发射强度较大的光源，才能将高浓度参比溶液的吸光度调至零，因此必须采用专门设计的示差分光光度计。

29. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 (二)多组分的同时测定 • 同时测定一种试样中的多种组分的基础是吸光度具有加合性，即总吸光度为各个组分吸光度的总和。

30. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 二、络合物组成和酸碱离解常数的测定 • （一）络合物组成的测定 • 1. 摩尔比法 • 应用分光光度法可以测定络合物的组成(络合比)和稳定常数。这里简要介绍一下用摩尔比法测定络合物的络合比。 • 设络合反应为 M + nR＝MRn • 通常是固定金属离子M的浓度，逐渐增加络合剂的浓度。配位体为R，显然，R应是无色的或在选定的波长范围内无显著吸收。然后稀释至同一体积，得到[R]／[M]为1，2，3……的一系列溶液，配制相应的试剂空白，在一定波长下，测定其吸光度，绘制曲线，用作图法求得络合比。

31. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • 曲线前部分表示，络合剂R浓度不断增加，生成的络合物不断增多，吸光度逐渐增大。当金属离子M全部形成络合物后，络合剂R的浓度再增加，吸光度达到最大值而不再变化。曲线峰部分转折不明锐、是由于络合物有微小离解造成的。曲线峰两线，交于D点，由D点向横轴作垂线，交于横轴的一点，这点的比值就是络合物的配合化。

32. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 2.等摩尔连续变化法 • 此法是保持溶液中cM+cR为常数，连续改变cR/cM配制出一系列溶液。分别测量系列溶液的吸光度A，以A对cM/(cM+cM)作图，曲线折点对应的cR/cM值就等于络合比n。 • 等摩尔连续变化法实用于络合比低、稳定性较高的络合物组成的测定。 • 此外还可以测定络合物的不稳定常数。

33. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 • （二）酸碱离解常数的测定 • 酸和碱的离解常数可用分光光度法测定，离解常数依赖于溶液的pH值。 • 设有一元弱酸HB，按下式离解： • HB =H+ + B- • Ka=[B-][H+]/[HB] 配制三种分析浓度c=[HB]+[B-]相等而pH不同的溶液。第一种溶液的pH在pKa附近，此时溶液中HB与B-共存，用1cm的吸收池在某一定的波长下，测量其吸光度：

34. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 第二种溶液是pH比pKa低两个以上单位的酸性溶液，此时弱酸几乎全部以HB型体存在，在上述波长下测得吸光度 第三种溶液是pH比pKa高两个以上单位的碱性溶液，此时弱酸几乎全部以B-型体存在，在上述波长下测得吸光度

35. 第31讲 第十章 吸光光度法 第2讲 将上各式整理得： 上式即为用分度法测定一元弱酸解离常数的基本公式。 三、双波长分光光度法（略）