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Elettroforesi. Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico. Principio:. Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA .

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elettroforesi

Elettroforesi

Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine,

Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico

slide2

Principio:

  • Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.
  • Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA.
    • Forza elettrica : Fel = q · E
    • Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r )
  • Quando le forze si bilanciano:
          • q ·E = f ·v
          • q
          •  v = — · E
  • f
        • v q
        • mobilità elettroforetica : = — = —
        • E f
slide4

Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:

V = R I

W = R I2

  • Operare a I costante
  • Dissipare l’eccesso di calore
slide12
Acrilamide, bisacrilamide  monomeri
  • Ione perossodisolfato  iniziatore
  • TEMED  catalizzatore
  • L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione
slide14
La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a quella che ci si aspettera
  • Effetto setaccio del supporto di separazione
  • Grafico di Ferguson:
    • Mobilità elettroforetica in funzione della concentrazione del gel
slide16

MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”

Se q  L,  in assenza di gel e’ pressoché indipendente dalle dimensioni molecolari

slide21

Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto

pozzetti

1

2

3

4

5

6

7

8

-20

-10

-7.0

x

distanza in cm dai pozzetti

slide22

Log kb

X=log10 0,54

100,54= Kb 3,46

1.30

1.00

0.80

0.69

0.60

0.47

0.30

0.20

0.00

-0.15

-0.3

X

0 1 2 3 4 5 6

Distanza in cm dal pozzetto

Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire

una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono

costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del peso

molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logarittimico, si

dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal

pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare

approssimativo

kb

20

10

7

5

4

3

2

1,6

1

0.7

0,5

slide30

SDS-PAGE

(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)

Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare

slide34

SDS-PAGE : elettroforesi discontinua

Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] > [proteina-SDS] > [glicinato].

Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.

slide36

Colorazione con Coomassie

Colorazione con nitrato di Ag

Si possono effettuare valutazioni

quantitative delle bande proteiche

col densitometro: misurazione della

luce trasmessa quando un raggio luminoso

è fatto passare attraverso il gel colorato.

Si hanno picchi di assorbimento di cui si può

calcolare l’area che è proporzionale

alla quantità di proteina

applicazioni della sds page
Applicazioni della SDS-PAGE
  • Purezza del campione
  • Determinazione del PM
  • Western blot
  • Purificazione della proteina
applicazioni dell sds page
Applicazioni dell’SDS-PAGE

Determinazione del PM