Elettroforesi
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Elettroforesi. Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine, Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico. Principio:. Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico. Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA .

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Presentation Transcript


Elettroforesi

Elettroforesi

Separazione differenziata di molecole cariche (aminoacidi, peptidi, proteine,

Acidi nucleici, ecc) sottoposte a un campo elelttrico


Elettroforesi

Principio:

  • Migrazione di particelle cariche sotto l’azione di un campo elettrico.

  • Tecnica sia ANALITICA che PREPARATIVA.

    • Forza elettrica : Fel = q · E

    • Forza frizionale : Ffr = f ·v (f = 6 r )

  • Quando le forze si bilanciano:

    • q ·E = f ·v

    • q

    •  v = — · E

  • f

    • v q

    • mobilità elettroforetica : = — = —

    • E f


  • Elettroforesi

    Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:

    V = R I

    W = R I2

    • Operare a I costante

    • Dissipare l’eccesso di calore


    Elettroforesi

    Acidi nucleici


    Elettroforesi

    ELETTROFORESI SU SUPPORTO

    su carta

    su gel


    Elettroforesi

    Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale


    Elettroforesi

    Formazione di un gel di poliacrilammide

    CH2


    Elettroforesi

    • Acrilamide, bisacrilamide  monomeri

    • Ione perossodisolfato  iniziatore

    • TEMED  catalizzatore

    • L’ossigeno è un radicale, quindi interferisce con la polimerizzazione


    Elettroforesi

    • La mobilità elettrofoertica risulta inferiore a quella che ci si aspettera

    • Effetto setaccio del supporto di separazione

    • Grafico di Ferguson:

      • Mobilità elettroforetica in funzione della concentrazione del gel


    Elettroforesi

    Effetto “setaccio” in un gel uniforme


    Elettroforesi

    MOBILITA’ ELETTROFORETICA ED EFFETTO “SETACCIO MOLECOLARE”

    Se q  L,  in assenza di gel e’ pressoché indipendente dalle dimensioni molecolari


    Elettroforesi

    Migrazione di proteine e DNA in gel di varia porosita’


    Elettroforesi

    Visualizzazione del DNA: etidio bromuro

    luce UV


    Elettroforesi

    Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso molecolare del campione ignoto

    pozzetti

    1

    2

    3

    4

    5

    6

    7

    8

    -20

    -10

    -7.0

    x

    distanza in cm dai pozzetti


    Elettroforesi

    Log kb

    X=log10 0,54

    100,54= Kb 3,46

    1.30

    1.00

    0.80

    0.69

    0.60

    0.47

    0.30

    0.20

    0.00

    -0.15

    -0.3

    X

    0123456

    Distanza in cm dal pozzetto

    Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire

    una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono

    costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log10 del peso

    molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logarittimico, si

    dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal

    pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare

    approssimativo

    kb

    20

    10

    7

    5

    4

    3

    2

    1,6

    1

    0.7

    0,5


    Elettroforesi

    SDS-PAGE

    (Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)

    Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare


    Elettroforesi

    SDS-PAGE : elettroforesi discontinua

    Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] > [proteina-SDS] > [glicinato].

    Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.


    Elettroforesi

    Colorazione con Coomassie

    Colorazione con nitrato di Ag

    Si possono effettuare valutazioni

    quantitative delle bande proteiche

    col densitometro: misurazione della

    luce trasmessa quando un raggio luminoso

    è fatto passare attraverso il gel colorato.

    Si hanno picchi di assorbimento di cui si può

    calcolare l’area che è proporzionale

    alla quantità di proteina


    Applicazioni della sds page

    Applicazioni della SDS-PAGE

    • Purezza del campione

    • Determinazione del PM

    • Western blot

    • Purificazione della proteina


    Applicazioni dell sds page

    Applicazioni dell’SDS-PAGE

    Determinazione del PM


    Elettroforesi

    Western blotting


    Elettroforesi

    Elettroforesi delle proteine plasmatiche


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