Люкманова Екатерина Назымовна Лаборатория биоинженерии белка , ИБХ РАН

1. БЕСКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ ТРАНСКРИПЦИИ-ТРАНСЛЯЦИИ: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПРОДУКЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ И ИХ ДОМЕНОВ Люкманова Екатерина Назымовна Лаборатория биоинженерии белка, ИБХ РАН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. ОвчинниковаРАН

2. Биосинтез белка транскрипция трансляция

3. История открытия бесклеточных белоксинтезирующих систем (ББС) 1950, Winnick – демонстрация возможности белкового синтеза с использованием экстракта, полученного после разрушения клеток 1958, Roberts – используя отдельные компоненты разрушенной клетки, показана ключевая роль рибосом, как белок-синтезирующих машин 1960, Lamborg&Zamecnik – создание первых ББС, представляющих собой смесь неочищенного клеточного экстракта, аминокислот, АТФ и ГТФ. 1963, Nirenberg – удаление эндогенных мРНК из экстракта и внесение экзогенной мРНК привело к ее трансляции и синтезу целевого белка 1988, Спирин А.С. – создание белоксинтезирующей системы длительного действия • изучение биосинтеза белка и механизмов его регуляции • скрининг белков с неизвестными функциями • белковая инженерия in vitro • аналитическая и препаративная продукция • рекомбинантных белков

4. Бесклеточные белоксинтезирующие системы клеточный экстракт + аминокислоты + экзогенная матрица + + энергетические компоненты + система регенерации энергии + кофакторы = бесклеточная белоксинтезирующая система Приготовление экстракта Экстракты: Прокариотические (основанные на экстракте Escherichia coli) Эукариотические (на основе экстракта пшеницы,ретикулоцитов кролика, клеток насекомых или человеческих клеток) Компоненты экстрактов: рибосомы, все ферменты и факторы, необходимые для транскрипции и трансляции Imataka et. al., 2011

5. Бесклеточные белоксинтезирующие системы. Матрицы. Ионный состав. • ДНК-независимая ББС • мРНК • ДНК-зависимая ББС транскрипции-трансляции • плазмидная ДНК, содержащая ген целевого белка и Т7промотор • ПЦР-фрагмент, содержащий ген целевого белка и Т7промотор • + Т7-РНК-полимераза Ионы, важные для работы ББС: Mg2+, K+, NH4+ В каждом конкретном случае требуется оптимизация по ионному составу и концентрации матрицы! Bernhard et al

6. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Пути расходования энергии. • NTP→ NDP при транскрипции • GTP → GDP при трансляции • ATP → AMP приприсоединении АКк tRNA

7. фермент НДК X – фосфоенолпируват COOH, фермент - пируваткиназа C-О-P CH2 X – ацетилфосфат CH3, фермент - ацетилкиназа C-О-P X – креатинфосфат COOH, фермент - креатинкиназа CH2 NH C-NH2 N-P Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Регенерация NTP. ADP + X-P ATP + X NDP + ATP NTP+ADP

8. Бесклеточные системы транскрипции-трансляции. Устройство реактора (batch). выход белка ≤ 0.5 мг/мл, эффективность работы ≤ 2 часа

9. Бесклеточные системы длительного действия : диализного типа – CECF (continuous exchange cell-free) (А) и проточного типа – CFCF (continuous flow cell-free)(Б) (А)Spirin et. al, Science, 1988 (Б)Endo et al, J Biotech 1992 Компоненты питающей смеси: ATP, GTP, UTP, CTP, аминокислоты, энергетические компоненты выход белка до 6 мг/мл, эффективность работы до 24 часов

10. Преимущества бесклеточных систем синтеза • «Эксклюзивный» синтез целевого белка с чистотой до 80% • Возможность манипулирования составом реакционной смеси • «Открытость» системы для добавления лигандов, кофакторов, специальных агентов • Низкая цена по сравнению с бактериальной продукцией • Эффективность по времени (1 день→ несколько миллиграмм целевого белка) • Масштабируемость до 100 литров Maslennikov et. al., PNAS, 2010

11. Бесклеточные белоксинтезирующие системы токсичные белки мультимерные белки мембранные белки белки, содержащие S-S связи белки,содержащие селективные метки белки,содержащие пост-трансляционные модификации белки,содержащие неприродные АК

12. Бесклеточный синтез N-гликозилированных белков Встраивание эукариотическихN-гликанов возможно требует использования модифицированных LLO и дальнейшего ферментативного трансгликозилирования (Schwarz et al, Nat Chem Biol, 2010)

13. Бесклеточный синтез белков, содержащих S-S связи (Swartzet al, J. Biotechnology, 2011)

14. Бесклеточный синтез белков, содержащих неприродные АК Использование мутантных tyrosyl-tRNA синтетазы (TyrRS), и tRNATyr из археи Methanococcus jannaschii в БСС на основе экстракта E. coliпозволяет встраивать неприродные аналоги тирозина и фенилаланина по стоп кодону TAG ("amber"). p-acetyl-Lphenylalanine p-azido-L-phenylalanine O-methyl-L-tyrosine (Goerkeet al, Biotechnology&Bioengineering 2009)

15. Бесклеточный синтез мембранных белков (МБ) • Фармакология • Медицина • Промышленные ферменты • Экология • Нанотехнологии Синтез МБ: a.в виде осадка ТС b.в присутствии мицелл детергента c.в присутствии липидов С1. в присутствии бицелл С2. в присутствии липид-белковых нанодисков С3. в присутствии липосом Bernhard et. al., 2010

16. Использование ББС для структурных исследований МБ (Junge et al, Cell Mol Life Sci, 2008) МБ человека, NMR (Klammt, Maslennikov et al, Nature methods, 2012) Бактериальные рецепторные His киназы, NMR (Maslennikov et al, PNAS, 2010) multidrug транспортер EmrE, X-ray (Chen et al, PNAS, 2007) Протеородопсин, NMR (Reckel et al, Angew Chem, 2011)

17. Пространственные структуры МБ, полученные в ИБХ РАН гомодимер ТМ домена рецептора фактора роста сосудистого эндотелия VEGFR2 гомотример мутантного варианта VEGFR2(V769E) (Mineev, Arseniev et al, 2013) гомодимер ТМ домена рецепторной тирозин киназы ErbB3 человека (TM-ErbB3) (Mineev et al, BBA, 2011)

18. Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков EmrE (multidrug transporter) Katzen et. al., Trends in Biotech., 2009

19. Сравнение различных подходов для продукции мембранных белков в структурированном виде • МБ с различной топологией • TM-ErbB3 (гомодимерный трансмембранный домен тирозинкиназы человека ErbB3, 1TM) • VSD (вольт-сенсорный домен K+ канала KvAP изAeropyrum pernix, 4TM) • ESR (бактериородопсин изExiguobacterium sibiricum, 7TM) • Тестируемые подходы • синтез в присутствии • детергентных мицелл • липид-детергентных бицелл • липид-белковых нанодисков (ЛБН) • ренатурация из осадка трансляционной смеси (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

20. Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл детергентов (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

21. Бесклеточная продукция МБ в присутствии мицелл детергентов Ни один из тестируемых детергентов не обеспечил синтеза функционально активного ESR и структурированных TM-ErbB3 и VSD (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

22. Бесклеточная продукция МБ в присутствии DMPC/DHPC бицелл (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

23. Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков Тестируемый липидный состав ЛБН 1) DMPC 2) DMPG 3) POPC 4) POPC/DOPG (3:2) Пустые ЛБН TM-ErbB3 VSD ESR Только ЛБН, состоящие из насыщенных липидов, стабильны при ко-трансляционном встраивании МБ (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

24. Бесклеточная продукция МБ в присутствии липид-белковых нанодисков Ни в одном случае с ЛБН не удалось синтезировать VSD в структурированном виде Дляпродукции VSD были разработаны системы рефолдинга (ренатурации) из осадка ТС (Lyukmanova et al, BBA, 2012)

25. N-концевые белки-партнеры для увеличения эффективности бесклеточной продукции рецепторов семейства GPCR • ~ 800 генов в геноме человека (отвечают за рецепцию света, гормонов, запахов, нейромедиаторов) • GPCR – мишени для ~ 30% современных лекарственных препаратов эффективность синтеза GPCR возросла в 5-38 раз Патентная заявка РФ, Люкманова и д.р., Acta Naturae 2012

26. ВЭЖХ анализ эффективности взаимодействия с телензипином осадок трансляционной смеси перевод в подходящую мембраномоделирующую среду для ренатурации солюбилизация 1% SDS Ренатурация мускаринового ацетилхолинового рецептора М1 типа из осадка трансляционной смеси бицеллы CHAPS/DMPC смешанные мицеллы DDM/CHS мицеллы DPC липосомы POPC

27. Бесклеточная продукция ТМ фрагментовβ2-адренорецептора человека (GPCR) S2/DPC S1/DPC S12/HFIP • Преимущества БСС: • Быстрая наработка (прямая экспрессия) миллиграммовых количеств гидрофобных пептидов (ТМ фрагментов МБ) • Эксклюзивный синтез целевого белка S1 S2 S12 MERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTGSHHHHHH MFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHH MERDEVWVVGMGIVMSLIVLAIVFGNVLVITAIAKFERLQTVTNYFITSLAVADLVMGLAVVPFGAAHILMKMWTGSHHHHHH

28. Бесклеточная продукция потенциалочувствительных доменов Na+ каналов эукариот • На ПЧД 2й псевдосубъединицы локализован участок связывания бета-токсинов из яда скорпионов • Каналы семейства Nav – перспективная мишень для создания новых лекарственных препаратов, нацеленных на лечение судорожных расстройств, хронической боли, периодического паралича, миотонии, атаксии и аритмий • Каналы семейства Nav – мишени для создания новых инсектицидов

29. Δδ13Сα Δδ13С’ ЯМР-исследование ПЧД-Nav1.4 • Исследование 13C 15N-меченого ПЧД-Nav1.4(5% LPPG, pH 6.0) • Получен набор 2D и 3D спектров для отнесения сигналов • В спектрах наблюдаются ~ 130 спиновых систем (близко к ожидаемому) • В настоящее время получено последовательное отнесение для 63 остатков (~ 40%) • Наблюдаются нарушения спиральной структуры «вольт-сенсорной спирали» S4 S1 S2 S3 S4 S45

30. Благодарю за внимание!