丙型肝炎实验诊断研究进展
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 44

丙型肝炎实验诊断研究进展 山东省临床检验中心 卢志明 PowerPoint PPT Presentation


  • 60 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

丙型肝炎实验诊断研究进展 山东省临床检验中心 卢志明. 丙型肝炎病毒. 1 、有包膜 , 属黄病毒科,丙型肝炎属。 2 、单股正链 RNA (9.6 kb) 3 、 T ½ :  2.7 小时 4 、每日复制量: 10 兆 (10 12 ) 病毒颗粒. Purcell RH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997. Neumann AU et al. Science . 1998;282:103-107.

Download Presentation

丙型肝炎实验诊断研究进展 山东省临床检验中心 卢志明

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


6522884

丙型肝炎实验诊断研究进展山东省临床检验中心卢志明


6522884

丙型肝炎病毒

1、有包膜,属黄病毒科,丙型肝炎属。

2、单股正链 RNA (9.6 kb)

3、T½: 2.7 小时

4、每日复制量:10 兆 (1012)

病毒颗粒

  • Purcell RH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997.

  • Neumann AU et al. Science. 1998;282:103-107.

  • Rosenberg S. J Mol Biol. 2001;313:451-464.

  • Lauer GM, Walker BD. N Engl J Med. 2001;345:41-52.


6522884

HCV的病毒命名

  • 从非甲非乙型肝炎到丙型肝炎:

  • 1968-1974年间,HAV、HBV诊断方法相继建立,人们发现还有一种引起输血后肝炎的致病因子.

  • 1974年纽约的Pince对204例术后病人随访,6个月51人(25%)发生了输血后肝炎,仅12人与HBV有关.CMV显然不是输血后肝炎的原因.

  • 1989年9月在东京会议上命名此种病毒为丙型肝炎病毒(HCV),由此引发的肝炎称之为丙型肝炎(HC).


6522884

HCV基因组结构

  • HCV为单股正链RNA病毒

  • 5`NC区、3`NC区为非编码区

  • 5`NC与3`NC间分结构编码区:C区、E1、E2;非结构编码区:NS1~5

  • 5`NC区最保守,C区较保守,E2/NS1有高变区(HVR1)


6522884

表 HCV表达蛋白的特性和功能


6522884

全球丙肝的流行情况

1、WHO的资料表明,全世界已有约1.7亿丙型肝炎病毒感染者。

2、急性HCV感染者中8O-90%可发展为慢性肝炎,其中约20-30%会缓慢进展为肝硬化。1-5%发展为肝癌。

3、HCV主要经血液和血液制品传播。

至今还没有预防丙型肝炎的疫苗问世,治疗效果不是十分理想。因此,建立一种针对HCV的具有高灵敏度、特异性和稳定性的检测方法,对于防止HCV传播、HCV感染的早期诊断和治疗具有重要意义。


6522884

我国丙型肝炎流行情况

  • 一般人群抗-HCV流行率: 3.2%

  • 估计HCV感染人数: 3 800万

目前经过血源的管理,丙肝发病率应当有所下降,

但有大量病人未被发现和治疗

( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )


6522884

我国各省市自治区HCV抗体 流行率

黑龙江

吉林

内蒙古

辽宁

新疆

北京

甘肃

天津

河北

宁夏

山西

山东

青海

江苏

陕西

河南

西藏

上海

安徽

湖北

四川

浙江

重庆

江西

>3%( 14 省)

湖南

福建

贵州

2~3%( 11 省)

云南

台湾

广东

广西

<2%( 6 省)

海南

( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )


6522884

我国HCV基因型调查

1、HCV 1b型是主要的基因型,其检出率达83.17%。

2、HCV 2型检出率低,占6.86%;其余为1b、2、4b型的混合型。

3、HCV 1b检出率在<30岁、30~49岁、>50岁组分别为77.77%、83.92%、90.90%。

4、HCV 1b在女性感染的比率较高(93.61%),男性为75%,差异有极显著的统计意义(p<0.01)。

5、HCV 1b型在感染时间>10年和<10年病人中的检出率分别为100%和80.43%(p<0.01) 。


6522884

HCV基因型在中国的分布以1b型为主,2a型为辅助

佳木斯

佳木斯

Jiamusi

Jiamusi

沈阳

沈阳

Shenyang

Shenyang

北京

北京

哈密

哈密

Beijing

Beijing

Hami

Hami

兰州

兰州

Lanzhou

Lanzhou

南京

南京

Nanjing

长沙

Nanjing

成都

成都

Chengdu

Chengdu

6

a

II/1b

6

a

II/1b

南宁

南宁

Nanning

Nanning

Wang Y, et al. J Med Viral, 1993,40:254-260

庄辉,等. 中华流行病学杂志, 2001,22:99-101

II/III

III/2a

II/III

III/2a

HCV 感染:中国 HCV 基因型的地理分布


6522884

HCV感染的自然史

100 位 HCV 急性感染

80% 持续感染

20% 痊愈

30%

稳定,慢性,无进展

40% 有不同程度进展

30% 呈严重进展

肝脏疾病终末期,肝细胞癌,肝脏移植,死亡

Adapted from Alter HF, Seeff LB. Semin LiverDis. 2000;20:17-35


6522884

丙型肝炎病毒(HCV)感染危害性不容忽视

  • 全球性流行 ——3% (1.7 亿)

  • 慢性化的危险性 —— 60%–85%

  • 临床诊断病例 —— < 30%

  • 肝硬化的危险性 ——在感染后20年内达 10% 在感染后30年内达20%

  • 肝硬化患者中肝细胞癌 ——1%–4%/年 (美国)的发生率 ~ 7% (日本、台湾)

  • 失代偿肝硬化10年存活率 —— 25%

  • 肝硬化相关性病死率 —— 1%–5%/年

WHO. Hepatitis C. Fact sheet no. 164.

Emmet B. Keeffe, MD, Medscape Gastroenterology eJournal, 2002, 4(2)

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002

Consensus statements on the prevention and management of hepatitis B and C in the Asia-pacific region


6522884

HCV的感染人数 = 临床病例?

  • 发病隐匿

  • 基层临床医生认识不足

  • 丙肝检测没有纳入常规查体项目

  • 确诊比较难,费用高

  • 抗体的窗口期,RNA的假阴性**

    ——临床诊断病例少


6522884

高感染率、低诊断率

高慢性化率

无有效疫苗预防

认识不足

问题与挑战

美国:

在2015年以前,临床诊断HCV的成人病例数增加4倍

中国:

挑战?!

挑战!!

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:

Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002


6522884

我 们 如 何 应 对 挑 战?

1、制定中国丙肝防治指南:规范丙肝的筛查,

诊断和治疗。

2、加强丙肝疾病和诊疗对基层医生的教育。

3、重视临床一线对丙肝的筛查。

4、通过各种途径提高公众对丙肝的防范意识:

如媒体等。


6522884

近年来丙肝研究进展

  • 丙肝分型、病毒复制、病毒变异等

  • 慢性化机制、脂肪变性、癌变机理等

  • 抗病毒治疗:I型应答率40%;II型应答率80%

  • 特异性靶向抗病毒治疗(2期临床)


6522884

实验室诊断进展

  • 多抗原包被的抗体检测(第3代抗-HCV)

  • HCV-Ag的检测(第4代)

  • 抗原-抗体联合检测(筛查)

  • HCV的基因分型

  • HCV-RNA的检测

    ——总之,实验室诊断研究进展?


6522884

实验室诊断方法

HCV-RNA定性试验PCR、TMA

HCV血清学试验

EIA检测HCV抗原

  • HCV-RNA定量试验PCR、bDNA

诊断、监测

方法

HCV血清学试验

EIA检测抗HCV

基因分型

ALT

肝活检

肝纤维化非损伤试验

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:

Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002


6522884

常用的检测方法

  • 酶联免疫吸附试验-HCV抗体检测

  • 酶联免疫吸附试验- HCV核心抗原检测

  • 免疫学方法-免疫印迹法(RIBA)

  • 免疫学方法-血清学分型

  • 分子生物学方法-HCV-PCR定量、HCV-PCR定性

  • 分子生物学基因分型方法-型特异PCR分型法、型特异探针杂交法、限制性长度多态性分析法(RFIJP)、核酸序列分析法、酶切分型法、基因芯片等


6522884

100

80

60

40

20

0

Analyte Level

Anti- HCV

HCV- RNA

HCV- Ag

Time

HCV RNA Window = approximately 11~13 days

HCV Ag Window = 12~14 days

Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen)

= 82 days(2nd Gen)

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

清学分型


6522884

100

80

60

40

20

0

Analyte Level

Anti- HCV

HCV- RNA

HCV- Ag

Time

HCV RNA Window = approximately 11~13 days

HCV Ag Window = 12~14 days

Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen)

= 82 days(2nd Gen)

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

清学分型


6522884

窗口期

主要原因

HCV抗体检测应用的不足

  • 目前国内主要应用抗HCV/EIA检测抗体,经抗体筛选后,临床上仍有少量的输血后丙肝的发生。


6522884

丙肝抗体假阴性问题

1.窗口期

2.静默感染

(immunosilent infection)

3.试剂质量

4.其它


6522884

HCV抗体检测应用的不足

1、不能用于丙型肝炎的早期诊断。

2、临床上不能区分既往感染和现症感染。

3、抗病毒治疗不一定造成抗HCV阴转,不能用于抗病毒疗效的检测。


Hcv rna

血清HCV-RNA的检测

  • 血清HCV-RNA的定性检测:

    容易产生假阳性或假阴性(PCR产物易产生污染)

  • 血清HCV-RNA的定量检测:

    缺点:RNA降解容易出现假阴性

    优点:可用于抗病毒治疗的选择与疗效监测


6522884

免疫学方法-免疫印迹法

  • 重组免疫印迹法(Recornbinant immunobIot,

    RIBA)RIBA是FDA批准的抗HCV补充试验.主要是

    解决ELISA试验中的假阳性问题。

  • 目前广泛使用的RIBA一3非特异性反应明显减少,敏感度显著提高(99.5)。

  • 缺点是RIBA在操作上较ELISA困难,费时、成本

    高,因此限制了这项技术在临床上的普遍使用。


6522884

目前检测方法

  • 抗-HCV and HCV-RNA的检测

    ——不能满足临床早期、准确、可靠的要求。

  • RIBA实验操作复杂、费用较高、推广难


6522884

丙肝抗原检测

1、丙型肝炎早期感染诊断指标

2、丙型肝炎确诊指标

3、丙型肝炎治疗评价指标

4、丙型肝炎筛查指标


6522884

HCV核心抗原的检测

HCV感染过程

诊断用

早期检测

“筛查”

抗-HCV

“总”抗原

“总”抗原

(抗体结合)

“游离”抗原

时间

12-14天

70-80天

1 pg/ml 总HCV 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA


6522884

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

60

HCV RNA

50

“总”抗原

40

抗-HCV

30

早期检测

“筛查”

20

“游离”抗原

10

0

时间

1

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

■HCV RNA 11~13 days■ HCV Ag 12~14days ■Anti-HCV = 70 days(3rd Gen)

= 82 days(2nd Gen)

1 pg/ml 总HCV 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA


6522884

检验原理

通过对血清或血浆样品进行预处理,解离HCV抗原/抗体复合物并释放出所有核心抗原,经固相包被特异性抗体捕获后,再与酶标记抗体形成双抗体夹心复合物,最后加入酶底物显色,以产品规定的可见光波长临界OD值判断HCV抗原检测结果。


Hcv elisa

HCV抗原ELISA基本原理

抗HCV抗体-HRP

HRP

抗HCV体

样本处理

抗 原

HCV抗体

酶 联 板


6522884

不同亚型丙型肝炎病毒核心抗原的序列分析

  • 10 20 30 40 50 60

  • HCV 1 MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQDVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 1b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 2a MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 2b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 3 MSTLPKPQRK TKRNTIRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYVLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • 70 80 90 100 110 120

  • HCV 1 RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSPRGSRPSWGPT DPRRRSRNLG

  • HCV 1b RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG MGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRHRSRNLG

  • HCV 2a RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPTWGPT DPRHRSRNLG

  • HCV 2b RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG LGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNVG

  • HCV 3 RRQPIPKARQ SEGRSWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG

  • 130 140 150 160

  • HCV 1 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 1b KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 2a KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV GAPVGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 2b KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV MAPLGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 3 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV MAPVGGARRA LAHGVRALED


6522884

四株单抗亚型检定

2号(CAb-2) IgG2a

1号(CAb-1) IgG2a

3号(EAb-1) IgG2b

4号(EAb-2) IgG1


Hcv ag hcv rna

HCV-Ag和HCV-RNA检测的比较

  • HCV cAg HCV RNA

  • 样本储存的条件要求 普通 特殊

  • 样本的前处理试剂 不需要 需要

  • 特殊仪器要求 无 有

  • 实验人员的训练 普通 专业

  • 实验费用 低 高

根据我国目前的状况,HCV cAg检测更符合我国的国情,可

以为血液安全,临床诊断提供廉价,切实可行的检测方法.


6522884

丙肝抗体检测“窗口期”补充方案

1.检测丙肝抗原

2.检测丙肝病毒RNA

3.联合检测:HCV Ag + HCV RNA + HCV Ab


6522884

HCV实验室检测流程

RR阳性

EIA S/CO >3.8

ECi S/CO >8

阴性

报告

报告

HCV-Ag HCV-Ab

RR阳性S/CO比值<3.8

ECi S/CO < 8

HCV-Ab RIBA

HCV RNA NAT

阴性

报告

阳性

阴性

可疑

阳性

报告

报告

报告

其他结果评价

(如NAT、ALT)


6522884

丙肝确诊后的实验室检测

  • HCV基因分型——选择抗病毒治疗防案、疗效评价、确定疗程,预后判断

  • HCV-RNA定量的检测——评价抗病毒治疗的疗效

  • 丙肝抗原定量检测——即将上市,评价抗病毒治疗的疗效


6522884

HCV实验结果临床诊断分析

HCV RNA(+) (-)

HCV Ag (+) (-)

HCV Ab量由高 低

HCV RNA 持续 (+)

HCV Ag持续 (+)

HCV Ab 持续 (+)

支持自身清除

(15--20%)

急性丙肝

支持发展慢性丙肝

(80--85%)


6522884

HCV实验结果临床诊断分析

  • 慢性丙型肝炎

    • 慢性肝病患者: HCV RNA (+)

      HCV Ag (+)

      抗HCV (+)

    • 对免疫健全的HCV RNA(+)患者,其中HCV抗原、抗HCV (EIA) 阳性率 > 99%

    • 对某些透析或严重免疫缺陷患者, 尽管存在HCV RNA 复制, 但抗HCV (-), 可诊断为HCV感染者或慢性丙肝患者

慢性丙型肝炎


6522884

HCV实验结果临床诊断分析

  • 献血员或体检群体的筛查

    • 若抗HCV(+), HCV Ag(+), HCV RNA(+)

      为慢性丙肝或慢性HCV感染者

    • 若抗HCV(-), HCV Ag(+), HCV RNA(+)

      为 “ 窗 口 期 ”(70天)

      “静默感染”(immunosilent infection)

      是引起输血后丙肝的主要原因


6522884

总 结

1、丙肝是引起肝硬化、肝癌的主要原因之一,是危害人民生命健康的严重疾病,应引起临床医生的高度重视。

2、丙肝抗原的检测是抗-HCV窗口期及HCV-RNA假阴性的补充,丙肝抗原的定量检测是抗病毒治疗的评价指标。

3、丙肝无疫苗预防,起病隐匿,丙肝抗原、抗体的联合检测应成为常规临床检查项目,及早发现潜在病人。

4、HCV分型、HCV-RNA检测是选择抗病毒治疗方案、疗效评价、确定疗程,预后判断的重要指标。


6522884

谢谢!


  • Login