丙型肝炎实验诊断研究进展
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丙型肝炎实验诊断研究进展 山东省临床检验中心 卢志明. 丙型肝炎病毒. 1 、有包膜 , 属黄病毒科,丙型肝炎属。 2 、单股正链 RNA (9.6 kb) 3 、 T ½ :  2.7 小时 4 、每日复制量: 10 兆 (10 12 ) 病毒颗粒. Purcell RH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997. Neumann AU et al. Science . 1998;282:103-107.

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Presentation Transcript

丙型肝炎实验诊断研究进展山东省临床检验中心卢志明


丙型肝炎病毒

1、有包膜,属黄病毒科,丙型肝炎属。

2、单股正链 RNA (9.6 kb)

3、T½: 2.7 小时

4、每日复制量:10 兆 (1012)

病毒颗粒

  • Purcell RH. NIH Consensus Conference on Hepatitis C. 1997.

  • Neumann AU et al. Science. 1998;282:103-107.

  • Rosenberg S. J Mol Biol. 2001;313:451-464.

  • Lauer GM, Walker BD. N Engl J Med. 2001;345:41-52.


HCV的病毒命名

  • 从非甲非乙型肝炎到丙型肝炎:

  • 1968-1974年间,HAV、HBV诊断方法相继建立,人们发现还有一种引起输血后肝炎的致病因子.

  • 1974年纽约的Pince对204例术后病人随访,6个月51人(25%)发生了输血后肝炎,仅12人与HBV有关.CMV显然不是输血后肝炎的原因.

  • 1989年9月在东京会议上命名此种病毒为丙型肝炎病毒(HCV),由此引发的肝炎称之为丙型肝炎(HC).


HCV基因组结构

  • HCV为单股正链RNA病毒

  • 5`NC区、3`NC区为非编码区

  • 5`NC与3`NC间分结构编码区:C区、E1、E2;非结构编码区:NS1~5

  • 5`NC区最保守,C区较保守,E2/NS1有高变区(HVR1)


HCV表达蛋白的特性和功能


全球丙肝的流行情况

1、WHO的资料表明,全世界已有约1.7亿丙型肝炎病毒感染者。

2、急性HCV感染者中8O-90%可发展为慢性肝炎,其中约20-30%会缓慢进展为肝硬化。1-5%发展为肝癌。

3、HCV主要经血液和血液制品传播。

至今还没有预防丙型肝炎的疫苗问世,治疗效果不是十分理想。因此,建立一种针对HCV的具有高灵敏度、特异性和稳定性的检测方法,对于防止HCV传播、HCV感染的早期诊断和治疗具有重要意义。


我国丙型肝炎流行情况

  • 一般人群抗-HCV流行率: 3.2%

  • 估计HCV感染人数: 3 800万

目前经过血源的管理,丙肝发病率应当有所下降,

但有大量病人未被发现和治疗

( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )


我国各省市自治区HCV抗体 流行率

黑龙江

吉林

内蒙古

辽宁

新疆

北京

甘肃

天津

河北

宁夏

山西

山东

青海

江苏

陕西

河南

西藏

上海

安徽

湖北

四川

浙江

重庆

江西

>3%( 14 省)

湖南

福建

贵州

2~3%( 11 省)

云南

台湾

广东

广西

<2%( 6 省)

海南

( 全国病毒性肝炎血清流行病学调查 1992~1995 )


我国HCV基因型调查

1、HCV 1b型是主要的基因型,其检出率达83.17%。

2、HCV 2型检出率低,占6.86%;其余为1b、2、4b型的混合型。

3、HCV 1b检出率在<30岁、30~49岁、>50岁组分别为77.77%、83.92%、90.90%。

4、HCV 1b在女性感染的比率较高(93.61%),男性为75%,差异有极显著的统计意义(p<0.01)。

5、HCV 1b型在感染时间>10年和<10年病人中的检出率分别为100%和80.43%(p<0.01) 。


HCV基因型在中国的分布以1b型为主,2a型为辅助

佳木斯

佳木斯

Jiamusi

Jiamusi

沈阳

沈阳

Shenyang

Shenyang

北京

北京

哈密

哈密

Beijing

Beijing

Hami

Hami

兰州

兰州

Lanzhou

Lanzhou

南京

南京

Nanjing

长沙

Nanjing

成都

成都

Chengdu

Chengdu

6

a

II/1b

6

a

II/1b

南宁

南宁

Nanning

Nanning

Wang Y, et al. J Med Viral, 1993,40:254-260

庄辉,等. 中华流行病学杂志, 2001,22:99-101

II/III

III/2a

II/III

III/2a

HCV 感染:中国 HCV 基因型的地理分布


HCV感染的自然史

100 位 HCV 急性感染

80% 持续感染

20% 痊愈

30%

稳定,慢性,无进展

40% 有不同程度进展

30% 呈严重进展

肝脏疾病终末期,肝细胞癌,肝脏移植,死亡

Adapted from Alter HF, Seeff LB. Semin LiverDis. 2000;20:17-35


丙型肝炎病毒(HCV)感染危害性不容忽视

  • 全球性流行 —— 3% (1.7 亿)

  • 慢性化的危险性 —— 60%–85%

  • 临床诊断病例 —— < 30%

  • 肝硬化的危险性 ——在感染后20年内达 10% 在感染后30年内达20%

  • 肝硬化患者中肝细胞癌 —— 1%–4%/年 (美国)的发生率 ~ 7% (日本、台湾)

  • 失代偿肝硬化10年存活率 —— 25%

  • 肝硬化相关性病死率 —— 1%–5%/年

WHO. Hepatitis C. Fact sheet no. 164.

Emmet B. Keeffe, MD, Medscape Gastroenterology eJournal, 2002, 4(2)

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002

Consensus statements on the prevention and management of hepatitis B and C in the Asia-pacific region


HCV的感染人数 = 临床病例?

  • 发病隐匿

  • 基层临床医生认识不足

  • 丙肝检测没有纳入常规查体项目

  • 确诊比较难,费用高

  • 抗体的窗口期,RNA的假阴性**

    ——临床诊断病例少


高感染率、低诊断率

高慢性化率

无有效疫苗预防

认识不足

问题与挑战

美国:

在2015年以前,临床诊断HCV的成人病例数增加4倍

中国:

挑战?!

挑战!!

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:

Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002


我 们 如 何 应 对 挑 战?

1、制定中国丙肝防治指南:规范丙肝的筛查,

诊断和治疗。

2、加强丙肝疾病和诊疗对基层医生的教育。

3、重视临床一线对丙肝的筛查。

4、通过各种途径提高公众对丙肝的防范意识:

如媒体等。


近年来丙肝研究进展

  • 丙肝分型、病毒复制、病毒变异等

  • 慢性化机制、脂肪变性、癌变机理等

  • 抗病毒治疗:I型应答率40%;II型应答率80%

  • 特异性靶向抗病毒治疗(2期临床)


实验室诊断进展

  • 多抗原包被的抗体检测(第3代抗-HCV)

  • HCV-Ag的检测(第4代)

  • 抗原-抗体联合检测(筛查)

  • HCV的基因分型

  • HCV-RNA的检测

    ——总之,实验室诊断研究进展?


实验室诊断方法

HCV-RNA定性试验PCR、TMA

HCV血清学试验

EIA检测HCV抗原

  • HCV-RNA定量试验PCR、bDNA

诊断、监测

方法

HCV血清学试验

EIA检测抗HCV

基因分型

ALT

肝活检

肝纤维化非损伤试验

National Institute of Health Consensus Development Conference Statement:

Management of Hepatitis C:2002-June 10-12,2002


常用的检测方法

  • 酶联免疫吸附试验-HCV抗体检测

  • 酶联免疫吸附试验- HCV核心抗原检测

  • 免疫学方法-免疫印迹法(RIBA)

  • 免疫学方法-血清学分型

  • 分子生物学方法-HCV-PCR定量、HCV-PCR定性

  • 分子生物学基因分型方法-型特异PCR分型法、型特异探针杂交法、限制性长度多态性分析法(RFIJP)、核酸序列分析法、酶切分型法、基因芯片等


100

80

60

40

20

0

Analyte Level

Anti- HCV

HCV- RNA

HCV- Ag

Time

HCV RNA Window = approximately 11~13 days

HCV Ag Window = 12~14 days

Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen)

= 82 days(2nd Gen)

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

清学分型


100

80

60

40

20

0

Analyte Level

Anti- HCV

HCV- RNA

HCV- Ag

Time

HCV RNA Window = approximately 11~13 days

HCV Ag Window = 12~14 days

Anti-HCV Window = 70 days(3rd Gen)

= 82 days(2nd Gen)

感染丙肝病毒后各指标检测时间表

清学分型


窗口期

主要原因

HCV抗体检测应用的不足

  • 目前国内主要应用抗HCV/EIA检测抗体,经抗体筛选后,临床上仍有少量的输血后丙肝的发生。


丙肝抗体假阴性问题

1.窗口期

2.静默感染

(immunosilent infection)

3.试剂质量

4.其它


HCV抗体检测应用的不足

1、不能用于丙型肝炎的早期诊断。

2、临床上不能区分既往感染和现症感染。

3、抗病毒治疗不一定造成抗HCV阴转,不能用于抗病毒疗效的检测。


Hcv rna
血清HCV-RNA的检测

  • 血清HCV-RNA的定性检测:

    容易产生假阳性或假阴性(PCR产物易产生污染)

  • 血清HCV-RNA的定量检测:

    缺点:RNA降解容易出现假阴性

    优点:可用于抗病毒治疗的选择与疗效监测


免疫学方法-免疫印迹法

  • 重组免疫印迹法(Recornbinant immunobIot,

    RIBA)RIBA是FDA批准的抗HCV补充试验.主要是

    解决ELISA试验中的假阳性问题。

  • 目前广泛使用的RIBA一3非特异性反应明显减少,敏感度显著提高(99.5)。

  • 缺点是RIBA在操作上较ELISA困难,费时、成本

    高,因此限制了这项技术在临床上的普遍使用。


目前检测方法

  • 抗-HCV and HCV-RNA的检测

    ——不能满足临床早期、准确、可靠的要求。

  • RIBA实验操作复杂、费用较高、推广难


丙肝抗原检测

1、丙型肝炎早期感染诊断指标

2、丙型肝炎确诊指标

3、丙型肝炎治疗评价指标

4、丙型肝炎筛查指标


HCV核心抗原的检测

HCV感染过程

诊断用

早期检测

“筛查”

抗-HCV

“总”抗原

“总”抗原

(抗体结合)

“游离”抗原

时间

12-14天

70-80天

1 pg/ml 总HCV 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA


感染丙肝病毒后各指标检测时间表

60

HCV RNA

50

“总”抗原

40

抗-HCV

30

早期检测

“筛查”

20

“游离”抗原

10

0

时间

1

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

■HCV RNA 11~13 days■ HCV Ag 12~14days ■Anti-HCV = 70 days(3rd Gen)

= 82 days(2nd Gen)

1 pg/ml 总HCV 核心抗原 = 8000 IU/ml HCV RNA


检验原理

通过对血清或血浆样品进行预处理,解离HCV抗原/抗体复合物并释放出所有核心抗原,经固相包被特异性抗体捕获后,再与酶标记抗体形成双抗体夹心复合物,最后加入酶底物显色,以产品规定的可见光波长临界OD值判断HCV抗原检测结果。


Hcv elisa

HCV抗原ELISA基本原理

抗HCV抗体-HRP

HRP

抗HCV体

样本处理

抗 原

HCV抗体

酶 联 板


不同亚型丙型肝炎病毒核心抗原的序列分析

  • 10 20 30 40 50 60

  • HCV 1 MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQDVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 1b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 2a MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 2b MSTNPKPQRK TKRNTNRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYLLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • HCV 3 MSTLPKPQRK TKRNTIRRPQ DVKFPGGGQI VGGVYVLPRR GPRLGVRATR KTSERSQPRG

  • 70 80 90 100 110 120

  • HCV 1 RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSPRGSRPSWGPT DPRRRSRNLG

  • HCV 1b RRQPIPKARQ PEGRTWAQPG YPWPLYGNEG MGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRHRSRNLG

  • HCV 2a RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPTWGPT DPRHRSRNLG

  • HCV 2b RRQPIPKDRQ STGKSWGKPG YPWPLYGNEG LGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNVG

  • HCV 3 RRQPIPKARQ SEGRSWAQPG YPWPLYGNEG CGWAGWLLSP RGSRPSWGPT DPRRRSRNLG

  • 130 140 150 160

  • HCV 1 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 1b KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV GAPLGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 2a KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV GAPVGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 2b KVIDTLTCGF ADLMGYIPVV MAPLGGARRA LAHGVRVLED

  • HCV 3 KVIDTLTCGF ADLMGYIPLV MAPVGGARRA LAHGVRALED


四株单抗亚型检定

2号(CAb-2) IgG2a

1号(CAb-1) IgG2a

3号(EAb-1) IgG2b

4号(EAb-2) IgG1


Hcv ag hcv rna
HCV-Ag和HCV-RNA检测的比较

  • HCV cAg HCV RNA

  • 样本储存的条件要求 普通 特殊

  • 样本的前处理试剂 不需要 需要

  • 特殊仪器要求 无 有

  • 实验人员的训练 普通 专业

  • 实验费用 低 高

根据我国目前的状况,HCV cAg检测更符合我国的国情,可

以为血液安全,临床诊断提供廉价,切实可行的检测方法.


丙肝抗体检测“窗口期”补充方案

1.检测丙肝抗原

2.检测丙肝病毒RNA

3.联合检测:HCV Ag + HCV RNA + HCV Ab


HCV实验室检测流程

RR阳性

EIA S/CO >3.8

ECi S/CO >8

阴性

报告

报告

HCV-Ag HCV-Ab

RR阳性S/CO比值<3.8

ECi S/CO < 8

HCV-Ab RIBA

HCV RNA NAT

阴性

报告

阳性

阴性

可疑

阳性

报告

报告

报告

其他结果评价

(如NAT、ALT)


丙肝确诊后的实验室检测

  • HCV基因分型——选择抗病毒治疗防案、疗效评价、确定疗程,预后判断

  • HCV-RNA定量的检测——评价抗病毒治疗的疗效

  • 丙肝抗原定量检测——即将上市,评价抗病毒治疗的疗效


HCV实验结果临床诊断分析

HCV RNA(+) (-)

HCV Ag (+) (-)

HCV Ab量由高 低

HCV RNA 持续 (+)

HCV Ag持续 (+)

HCV Ab 持续 (+)

支持自身清除

(15--20%)

急性丙肝

支持发展慢性丙肝

(80--85%)


HCV实验结果临床诊断分析

  • 慢性丙型肝炎

    • 慢性肝病患者: HCV RNA (+)

      HCV Ag (+)

      抗HCV (+)

    • 对免疫健全的HCV RNA(+)患者,其中HCV抗原、抗HCV (EIA) 阳性率 > 99%

    • 对某些透析或严重免疫缺陷患者, 尽管存在HCV RNA 复制, 但抗HCV (-), 可诊断为HCV感染者或慢性丙肝患者

慢性丙型肝炎


HCV实验结果临床诊断分析

  • 献血员或体检群体的筛查

    • 若抗HCV(+), HCV Ag(+), HCV RNA(+)

      为慢性丙肝或慢性HCV感染者

    • 若抗HCV(-), HCV Ag(+), HCV RNA(+)

      为 “ 窗 口 期 ”(70天)

      “静默感染”(immunosilent infection)

      是引起输血后丙肝的主要原因


总 结

1、丙肝是引起肝硬化、肝癌的主要原因之一,是危害人民生命健康的严重疾病,应引起临床医生的高度重视。

2、丙肝抗原的检测是抗-HCV窗口期及HCV-RNA假阴性的补充,丙肝抗原的定量检测是抗病毒治疗的评价指标。

3、丙肝无疫苗预防,起病隐匿,丙肝抗原、抗体的联合检测应成为常规临床检查项目,及早发现潜在病人。

4、HCV分型、HCV-RNA检测是选择抗病毒治疗方案、疗效评价、确定疗程,预后判断的重要指标。



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