分子生物学
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分子生物学. 第六章 分子生物学研究法(下). ——基因功能研究技术. 第一节 基因表达研究技术 第二节 基因敲除技术. 2. 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术. 3. 转录组. 广义 所有mRNA,rRNA,tRNA,non-codingRNA 的总和 狭义 所有mRNA的总和 组学下的中心法则 基因组——转录组——蛋白质组. 4. 转录组的研究. 研究思路 特定条件下,细胞内mRNA丰度 描述 基因表达 水平 外推到 蛋白质产物的丰度 研究的基本方法

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分子生物学

第六章分子生物学研究法(下)

——基因功能研究技术

第一节基因表达研究技术

第二节基因敲除技术


2

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


3

转录组

广义

所有mRNA,rRNA,tRNA,non-codingRNA

的总和

狭义

所有mRNA的总和

组学下的中心法则

基因组——转录组——蛋白质组


4

转录组的研究

研究思路

特定条件下,细胞内mRNA丰度描述基因表达

水平

外推到蛋白质产物的丰度

研究的基本方法

基因芯片技术

转录组测序技术


5

转录组测序方法:EST

表达序列标签技术

Expressedsequencetag,EST

EST数据目前最多,但测序通量小,测序成本

高,不能得到基因表达丰度的信息


6

转录组测序方法:SAGE

基因表达系列分析技术Serialanalysisof

expression,SAGE

获得短的序列标签(10-14bp),确定转录信息

将短序列标签有序连接起来,克隆

定量测定标签的数量,从而得到其表达水平


7

SAGE


8

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


9

RNA的选择性剪接技术

用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生

不同的mRNA剪接异构体的过程

分类

平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、

外显子遗漏性剪接、相互排斥性剪接

研究方法

RT-PCR(real-timePCR)


10

RNA的不同选择性剪接方式

平衡剪接

5’选择性剪切

3’选择性剪切

外显子遗漏性剪切

相互排斥性剪切


11

RNA选择性剪接的研究方法:RT-PCR

不同组织来

源的RNA反转录

成cDNA

用相同引物进

行PCR

观察PCR产物

差异

分析是否来

源于选择性剪接


12

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


13

原位杂交技术(insituhybridization,ISH)

用标记的核酸探针,经放射自显影或非放

射检测体系,在组织、细胞、间期核及染色

体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种

手段

分类

RNA原位杂交

染色体原位杂交


14

RNA原位杂交

用放射性或非放射性标记的特异性探针与

被固定的组织切片反应

若细胞中存在与探针互补的mRNA分子,

两者杂交产生双链RNA,通过检测放射性标

记或者酶促免疫反应显色,对该基因的表达

产物在细胞水平上进行定性定量分析


15

RNA原位杂交

http://www.isogen-lifescience.com/uploads/iu/_5/iu_5xHGQvy-2tpZPukJKtA/ViewRNA-ISH-Tissue2.jpg


16

染色体原位杂交:荧光原位杂交

对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记,然

后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的

序列结合

再通过与荧光素分子偶联的单克隆抗体来

确定DNA在染色体上的位置

优点

不需放射性同位素,实验周期短,检测灵敏度

高,可同时观察几个DNA探针的定位


17

http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/11540248


18

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


19

基因定点突变技术(site-directedmutagenesis)

改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编

码的氨基酸序列

研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质的结

构、催化活性以及结合配体能力的影响

改造DNA调控元件特征序列,修饰表达载

体,引入新的酶切位点

目前无法精确预测氨基酸残基变化对整个

蛋白质结构和活性的影响


20

基因定点突变的方法

两种PCR方法

重叠延伸技术

大引物诱变法


21

重叠延伸技术:1/2

模板DNA5’

3’

3’

5’

引物变性和退火

FM

RM

F2

3’

5’

3’

5’

R2

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

PCR1

PCR2

重叠延伸、PCR3

5’

3’

3’

5’


22

重叠延伸技术:2/2

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

PCR4


23

大引物诱变法

5’

3’

3’

5’

R1

M

PCR1

5’

3’

3’

5’

大引物

大引物和野生型DNA分子混合,退火

5’

3’

5’

3’

X

3’

5’

5’

3’

PCR2

F2

5’

3’

3’

5’


24

PCR介导的定点突变的优点

突变体回收率高,有时不需进行突变体筛

能用双链DNA作为模板,可以在任何位点

引入突变

可在同一试管中完成所有反应

快速简便,无需在噬菌体M13上进行分子

克隆


25

目录

基因表达研究技术

基因敲除技术

基本原理

高等动物基因敲除技术

植物基因敲除技术


26

基本原理

又称基因打靶,通过外源DNA与染色体

DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰

和基因改造,具有专一性强,染色体DNA可

与目的片段共同稳定遗传等特点

1985年成功将外源质粒p∆β117插入到人

类染色体DNAβ-珠蛋白位点,首次在哺乳动

物细胞中进行成功的基因打靶


27

基因敲除技术的基本原理

分类

完全基因敲除

完全消除细胞或动物个体的靶基因活性

条件型基因敲除(不完全基因敲除)

特定时间和空间的基因敲除


30

完全基因敲除:正负双向选择原理(PNS)

正向选择基因neo插入或置换靶基因;

负向选择基因HSV-tk置于目的基因外侧,

含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上

生长,负向选择基因如果被随机重组到基因

组中会导致细胞死亡


28

正向选择基因neo插入或置换靶基因

neo

6

9

6

9

neo

1

23

45

6789

1

23

45

9

HPRT+

HPRT+

678

序列置换

序列插入

1

23

45

67neo9

HPRT+G418r

HPRT+G418r


29

目的基因

基因敲除载体

启动子1

2

3

4

HSV-tk

1neor12

3HSV-tk

同源重组

1

2

3

4

含有neor基因

的细胞能对抗抗生

素G418,不含有

HSK-tk基因的细

胞能对抗嘌呤类似

物丙氧鸟苷

HSV-tk

启动子

1neor123HSV-tk

抗生素G418,丙氧鸟苷

1neor1234

目的基因的第一个外显子被neor基因替换


31

条件型基因敲除

Neo加入到靶基因的内含子中,并在靶基因两侧内含子中插入LoxP位点


32

目录

基因表达研究技术

基因敲除技术

基本原理

高等动物基因敲除技术

植物基因敲除技术


33

真核生物基因敲除的技术路线

构建重组基因载体

将重组DNA导入胚胎干细胞纯系中,使外

源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发

生同源重组

重组载体中的DNA整合到内源基因组中,

并加以表达


34

高等动物基因敲除技术

目的

基因

tk

4a

1

neo

2

棕色小鼠

4a同源重组

4b非同源重组

4c未重组

3

4b

4c

5a代替野生型基因

5b随机插入

5c没有插入

6a含插入基因的细胞

6b含随机插入的细胞

6c不含插入的细胞

7收集细胞

8用抗生素G418和

丙氧鸟苷处理

5b

6b

7

8

5a

6a

5c

6c


35

在正常胚胎中植入

含插入基因的细胞

野生的雌性黑鼠

杂合子

将胚胎植入待孕黑色母体

新生的雄性嵌合鼠(棕色-黑色)

成熟的雄性嵌合鼠(棕色-黑色)

杂合子

纯合子,用于研究


36

基因捕获法

要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型,

至少需要两代以上的遗传

基因捕获法也可以破坏靶基因表达

基因捕获载体包括一个无启动子的报告基

因,通常是neo基因


37

基因捕获法

SAβgeo,无启动子

基因捕获载体

随机整合

内含子1

SAβgeo

外显子1

外显子1

外显子2

外显子2

随机插入内含子或外显子中

转录

剪切

翻译

5’

5’


38

目录

基因表达研究技术

基因敲除技术

基本原理

高等动物基因敲除技术

植物基因敲除技术


39

植物基因敲除技术

由于动植物细胞结构显著不同,植物细胞

基因敲除采用不同于动物基因敲除的方法

T-DNA插入失活技术是植物中使用最广泛

的基因敲除方法


40

T-DNA插入失活

利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化

将一段带有报告基因的DNA序列标签整合

到基因组DNA上

如果这段DNA插入到目的基因内部或附近,

就会影响基因的表达,从而使该基因失活。


41

LB

LP

LP

RP

RP

野生型杂合型纯合型

将靶基因两端的引物LP,RP及插入

载体上的引物LB加入同一反应体系

中进行PCR


42

小结

基因的分析技术

SAGE,RNA选择性剪接,原位杂交,基因定点

突变

基因敲除

正负双向筛选原理

条件型基因消除


六章分子生物学研究法(下)

——基因功能研究技术

第三节蛋白质及RNA相互作用技术

第四节基因芯片及数据分析


目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


酵母单杂交系统

20世纪90年代中期发展起来的新技术

可识别稳定结合于DNA上的蛋白质,用于

研究酵母细胞内DNA-蛋白质之间的相互作

通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作

用蛋白的编码基因

分析鉴定细胞中转录调控因子(一种蛋白

质)与顺式作用元件(一种DNA)相互作用


酵母单杂交系统的基本原理

转录激活结构域AD

转录因子

顺式元件

顺式元件

顺式元件

最基本启动子

报告基因

结构

顺式元件在启动子上游,报告基因在启动子下游

过程

转录因子与顺式元件结合,激活最基本启动子,使报告

基因表达

接入三个以上的顺式作用元件,可增强转录因子的

识别和结合效率


酵母单杂交系统的应用

确定某个DNA分子与某个蛋白质之间的相

互作用

分离编码结合在顺式作用元件或其他DNA

位点的功能蛋白的编码基因

验证反式作用因子的DNA结合结构域

准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序


酵母单杂交系统的应用

从拟南芥cDNA文库中筛选出能与DRE结合的转录调控因子

拟南芥cDNA插入片段

PADH1

GAL4AD

TADH1

LEU2

转化

DRE

DRE

DRE

最基本启动子

LacZ

DRE

URA3

筛选

挑选阳性克隆

测序,进一步验证活性

阳性克隆


目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


酵母双杂交系统

利用真核生物转录调控因子的组件式结构

特征

DNA结合结构域bindingdomain,BD

转录激活结构域activatingdomain,AD

BD能与启动子结合,不能激活转录

BD和AD形成的杂合蛋白,能激活转录


酵母双杂交系统

只有转录激活域AD不

能激活报告基因表达

只有转录结合域BD不

能激活报告基因表达

AD和BD同时存在时,

才能激活报告基因表达


酵母双杂交系统

BD

AD

Bait

DNA结合域

DNA转录激活域

诱饵

Prey猎物


目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


蛋白质分析技术

等离子表面共振技术

免疫共沉淀技术

GST融合蛋白沉降技术

荧光共振能量转移法


等离子表面共振技术

将诱饵蛋白结合于葡

聚糖表面,将葡聚糖固

定在纳米级金属膜表面

当有蛋白质混合物经

过时,如果有蛋白质同

诱饵蛋白发生作用,两

信号输出

诱饵蛋白

葡聚糖层

纳米级金属膜

光感受器

光源

棱镜

者结合使金属膜表面的

折射率上升,从而导致

共振角度的改变

共振角度的变化与捕

被捕获的

待分析物

自由的

待分析物

液流通路流向

获的蛋白浓度呈线性关


免疫共沉淀技术

将蛋白抗体基质复合体加入

含有不同组分的蛋白质溶液中

固体基质

特异性抗体

2

1

亲和试剂

与抗体特异

结合的蛋白质

结合后被共沉淀到

试管的底部


GST融合蛋白沉降技术(1)

GST谷胱甘肽转移酶;GSH谷胱甘肽

利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球的亲

和性,从混合蛋白质样品中纯化得到相互作

用蛋白

应用

确定探针蛋白和未知蛋白的相互作用

确定探针蛋白和某个已知蛋白之间的相互作用


GST融合蛋白沉降技术(2)

SDS-PAGE

分析

谷胱甘肽琼

脂糖球珠

35S标记细

胞裂解物

发生相互作用的蛋白

GST融合物

GST


荧光共振能量转移法(FRET)

荧光供体探针荧光受体

荧光

Taqman探针

荧光供体荧光受体

探针

分子信标

荧光


荧光共振能量转移法(FRET)

21世纪初发现,又称长距离能量转移

是荧光能量供体与受体之间通过偶极-偶极

耦合作用以非辐射方式转移能量的过程

条件

供体与受体距离合适(1-10nm)

供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重

供体与受体的偶极具有一定的空间取向



目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


染色质免疫共沉淀技术

chromatinimmunoprecipitation,ChIP

新发展的研究活体细胞内染色质DNA与蛋白

质相互作用的技术

主要实验流程

活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物

用超声波或酶处理将其随机切断为一定长度的染色

质小片段

利用抗原抗体反应,沉淀复合体,富集与目的蛋白

结合的DNA片段


利用甲醛使DNA

和蛋白质交联

将DNA转移到干净

离心管中,备用

破碎细胞,

切DNA

加入蛋白酶,解除

DNA-蛋白质交联

加入感兴趣的抗体

捕获抗体结合的

DNA-蛋白质复合物


目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


RNA干涉技术

RNAinterference,RNAi

1998年安德鲁·法尔在1998年Nature上发

表了该技术

利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内

同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出

现靶基因缺失的表型

对线虫注射外源双链RNA可诱发与之高度

同源的基因序列的特异性“沉默”


RNAi

多步骤过程

对触发物的加工

与目标mRNA的结合

目标mRNA的降解

双链RNA是RNAi的触发物,引发与之互补

的单链RNA的降解


RNAi过程

对触发物的加工

Dicer(一种核酸酶)将细胞中长的外源双链RNA

降解成21-25bp的小分子干扰RNA(siRNA)

与目标mRNA的结合

siRNA与目标mRNA结合

目标mRNA的降解

siRNA的反义链指导合成”RNA诱导的沉默复合体

(RISC)的核蛋白体”

RISC介导切割mRNA中与siRNA反义链互补的区

域,从而干扰靶基因表达


RNAi技术

外源双链RNA

Dicer

siRNA

细胞内mRNA

RISC切割

细胞内mRNA

干扰靶基因表达


RNAi技术的应用

非哺乳动物

可利用较长的dsRNA直接诱导RNAi, 无需专门

合成siRNA

将目的基因体外转录得到需要的dsRNA

通过浸泡、注射或转染靶细胞实现RNAi

哺乳动物

较长的dsRNA会导致非特异性基因沉默,只有

21-25bp的siRNA才有效


目录

蛋白质及RNA相互作用技术

基因芯片及数据分析

基因芯片技术原理

基因芯片的点制过程

基因芯片数据分析


基因芯片DNAchip

传统的实验方法如RT-PCR、Northern印

迹法研究时,受电泳泳道数量的限制,每次

只能研究很少量的基因

基因芯片能同时检测大量靶基因表达,迅

速准确地在基因组水平上阐述各种转录物的

变化规律


基因芯片技术的研究过程

用机械臂把大量已知或未知序列的DNA片

段点在玻璃片(2cm*2cm)、金属片或尼

龙膜上,经过物理吸附或化学合成达到固定

将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交,

经过计算机扫描

五个步骤:生物学问题、样品制备、生物

化学反应、检测、数据模型分析


基因芯片技术流程图

处理组

杂交

对照组

芯片上某些点能够

与荧光标记的cDNA

发生杂交,所发出的

荧光信号与基因表达

的丰度成正比

mRNA提取

荧光染料

标记cDNA

通过比较芯片上的

激光激发

每个位置的荧光强度

来确定基因丰度或表

达强度

芯片结果


目录

蛋白质及RNA相互作用技术

基因芯片及数据分析

基因芯片技术原理

基因芯片的点制过程

基因芯片数据分析


基因芯片的点制过程:简易基因芯片

不超过2000个基因

步骤与原理中描述相同

研究小部分特定基因的表达状态

手工制样或机械臂点样


基因芯片的点制过程:大规模基因芯片

大于10000个基因

点样方式:接触式、非接触式、半导体技术

过程

大规模PCR得到独立cDNA片段

用机械臂点样

从不同组织、器官或细胞分离mRNA,反转录成cDNA

用不同荧光染料标记不同cDNA样本

杂交

激光扫描芯片杂交结果,分析


目录

蛋白质及RNA相互作用技术

基因芯片及数据分析

基因芯片技术原理

基因芯片的点制过程

基因芯片数据分析


基因芯片数据分析

数据可靠性分析

重复试验以确保数据的准确

加上持家基因做内对照

生物学意义分析

差异表达基因的生物学意义

统计每条生物化学途径中固有的基因数量和被基因

芯片定位的差异表达的基因数量,计算出特定器官

或发育阶段表达有显著差异的代谢途径


小结

蛋白质相互作用

酵母单杂交、酵母双杂交、等离子表面共振、

GST融合蛋白、免疫共沉淀技术、FRET

RNAi技术

基因沉默

基因芯片

制备过程、用途


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