分子生物学
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分子生物学. 第六章 分子生物学研究法(下). ——基因功能研究技术. 第一节 基因表达研究技术 第二节 基因敲除技术. 2. 目录 基因表达研究技术 转录组测序 RNA的选择性剪接技术 原位杂交技术 基因定点突变技术 基因敲除技术. 3. 转录组. 广义 所有mRNA,rRNA,tRNA,non-codingRNA 的总和 狭义 所有mRNA的总和 组学下的中心法则 基因组——转录组——蛋白质组. 4. 转录组的研究. 研究思路 特定条件下,细胞内mRNA丰度 描述 基因表达 水平 外推到 蛋白质产物的丰度 研究的基本方法

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分子生物学

第六章分子生物学研究法(下)

——基因功能研究技术

第一节基因表达研究技术

第二节基因敲除技术


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2

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


4422487

3

转录组

广义

所有mRNA,rRNA,tRNA,non-codingRNA

的总和

狭义

所有mRNA的总和

组学下的中心法则

基因组——转录组——蛋白质组


4422487

4

转录组的研究

研究思路

特定条件下,细胞内mRNA丰度描述基因表达

水平

外推到蛋白质产物的丰度

研究的基本方法

基因芯片技术

转录组测序技术


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5

转录组测序方法:EST

表达序列标签技术

Expressedsequencetag,EST

EST数据目前最多,但测序通量小,测序成本

高,不能得到基因表达丰度的信息


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6

转录组测序方法:SAGE

基因表达系列分析技术Serialanalysisof

expression,SAGE

获得短的序列标签(10-14bp),确定转录信息

将短序列标签有序连接起来,克隆

定量测定标签的数量,从而得到其表达水平


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7

SAGE


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8

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


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9

RNA的选择性剪接技术

用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生

不同的mRNA剪接异构体的过程

分类

平衡剪接、5’选择性剪接、3’选择性剪接、

外显子遗漏性剪接、相互排斥性剪接

研究方法

RT-PCR(real-timePCR)


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10

RNA的不同选择性剪接方式

平衡剪接

5’选择性剪切

3’选择性剪切

外显子遗漏性剪切

相互排斥性剪切


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11

RNA选择性剪接的研究方法:RT-PCR

不同组织来

源的RNA反转录

成cDNA

用相同引物进

行PCR

观察PCR产物

差异

分析是否来

源于选择性剪接


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12

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


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13

原位杂交技术(insituhybridization,ISH)

用标记的核酸探针,经放射自显影或非放

射检测体系,在组织、细胞、间期核及染色

体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种

手段

分类

RNA原位杂交

染色体原位杂交


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14

RNA原位杂交

用放射性或非放射性标记的特异性探针与

被固定的组织切片反应

若细胞中存在与探针互补的mRNA分子,

两者杂交产生双链RNA,通过检测放射性标

记或者酶促免疫反应显色,对该基因的表达

产物在细胞水平上进行定性定量分析


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15

RNA原位杂交

http://www.isogen-lifescience.com/uploads/iu/_5/iu_5xHGQvy-2tpZPukJKtA/ViewRNA-ISH-Tissue2.jpg


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16

染色体原位杂交:荧光原位杂交

对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记,然

后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的

序列结合

再通过与荧光素分子偶联的单克隆抗体来

确定DNA在染色体上的位置

优点

不需放射性同位素,实验周期短,检测灵敏度

高,可同时观察几个DNA探针的定位


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17

http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/11540248


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18

目录

基因表达研究技术

转录组测序

RNA的选择性剪接技术

原位杂交技术

基因定点突变技术

基因敲除技术


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19

基因定点突变技术(site-directedmutagenesis)

改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编

码的氨基酸序列

研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质的结

构、催化活性以及结合配体能力的影响

改造DNA调控元件特征序列,修饰表达载

体,引入新的酶切位点

目前无法精确预测氨基酸残基变化对整个

蛋白质结构和活性的影响


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20

基因定点突变的方法

两种PCR方法

重叠延伸技术

大引物诱变法


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21

重叠延伸技术:1/2

模板DNA5’

3’

3’

5’

引物变性和退火

FM

RM

F2

3’

5’

3’

5’

R2

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

PCR1

PCR2

重叠延伸、PCR3

5’

3’

3’

5’


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22

重叠延伸技术:2/2

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

5’

3’

PCR4


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23

大引物诱变法

5’

3’

3’

5’

R1

M

PCR1

5’

3’

3’

5’

大引物

大引物和野生型DNA分子混合,退火

5’

3’

5’

3’

X

3’

5’

5’

3’

PCR2

F2

5’

3’

3’

5’


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24

PCR介导的定点突变的优点

突变体回收率高,有时不需进行突变体筛

能用双链DNA作为模板,可以在任何位点

引入突变

可在同一试管中完成所有反应

快速简便,无需在噬菌体M13上进行分子

克隆


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25

目录

基因表达研究技术

基因敲除技术

基本原理

高等动物基因敲除技术

植物基因敲除技术


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26

基本原理

又称基因打靶,通过外源DNA与染色体

DNA之间的同源重组,进行精确的定点修饰

和基因改造,具有专一性强,染色体DNA可

与目的片段共同稳定遗传等特点

1985年成功将外源质粒p∆β117插入到人

类染色体DNAβ-珠蛋白位点,首次在哺乳动

物细胞中进行成功的基因打靶


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27

基因敲除技术的基本原理

分类

完全基因敲除

完全消除细胞或动物个体的靶基因活性

条件型基因敲除(不完全基因敲除)

特定时间和空间的基因敲除


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30

完全基因敲除:正负双向选择原理(PNS)

正向选择基因neo插入或置换靶基因;

负向选择基因HSV-tk置于目的基因外侧,

含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上

生长,负向选择基因如果被随机重组到基因

组中会导致细胞死亡


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28

正向选择基因neo插入或置换靶基因

neo

6

9

6

9

neo

1

23

45

6789

1

23

45

9

HPRT+

HPRT+

678

序列置换

序列插入

1

23

45

67neo9

HPRT+G418r

HPRT+G418r


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29

目的基因

基因敲除载体

启动子1

2

3

4

HSV-tk

1neor12

3HSV-tk

同源重组

1

2

3

4

含有neor基因

的细胞能对抗抗生

素G418,不含有

HSK-tk基因的细

胞能对抗嘌呤类似

物丙氧鸟苷

HSV-tk

启动子

1neor123HSV-tk

抗生素G418,丙氧鸟苷

1neor1234

目的基因的第一个外显子被neor基因替换


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31

条件型基因敲除

Neo加入到靶基因的内含子中,并在靶基因两侧内含子中插入LoxP位点


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32

目录

基因表达研究技术

基因敲除技术

基本原理

高等动物基因敲除技术

植物基因敲除技术


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33

真核生物基因敲除的技术路线

构建重组基因载体

将重组DNA导入胚胎干细胞纯系中,使外

源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发

生同源重组

重组载体中的DNA整合到内源基因组中,

并加以表达


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34

高等动物基因敲除技术

目的

基因

tk

4a

1

neo

2

棕色小鼠

4a同源重组

4b非同源重组

4c未重组

3

4b

4c

5a代替野生型基因

5b随机插入

5c没有插入

6a含插入基因的细胞

6b含随机插入的细胞

6c不含插入的细胞

7收集细胞

8用抗生素G418和

丙氧鸟苷处理

5b

6b

7

8

5a

6a

5c

6c


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35

在正常胚胎中植入

含插入基因的细胞

野生的雌性黑鼠

杂合子

将胚胎植入待孕黑色母体

新生的雄性嵌合鼠(棕色-黑色)

成熟的雄性嵌合鼠(棕色-黑色)

杂合子

纯合子,用于研究


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36

基因捕获法

要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型,

至少需要两代以上的遗传

基因捕获法也可以破坏靶基因表达

基因捕获载体包括一个无启动子的报告基

因,通常是neo基因


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37

基因捕获法

SAβgeo,无启动子

基因捕获载体

随机整合

内含子1

SAβgeo

外显子1

外显子1

外显子2

外显子2

随机插入内含子或外显子中

转录

剪切

翻译

5’

5’


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38

目录

基因表达研究技术

基因敲除技术

基本原理

高等动物基因敲除技术

植物基因敲除技术


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39

植物基因敲除技术

由于动植物细胞结构显著不同,植物细胞

基因敲除采用不同于动物基因敲除的方法

T-DNA插入失活技术是植物中使用最广泛

的基因敲除方法


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40

T-DNA插入失活

利用根瘤农杆菌T-DNA介导转化

将一段带有报告基因的DNA序列标签整合

到基因组DNA上

如果这段DNA插入到目的基因内部或附近,

就会影响基因的表达,从而使该基因失活。


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41

LB

LP

LP

RP

RP

野生型杂合型纯合型

将靶基因两端的引物LP,RP及插入

载体上的引物LB加入同一反应体系

中进行PCR


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42

小结

基因的分析技术

SAGE,RNA选择性剪接,原位杂交,基因定点

突变

基因敲除

正负双向筛选原理

条件型基因消除


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第六章分子生物学研究法(下)

——基因功能研究技术

第三节蛋白质及RNA相互作用技术

第四节基因芯片及数据分析


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


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酵母单杂交系统

20世纪90年代中期发展起来的新技术

可识别稳定结合于DNA上的蛋白质,用于

研究酵母细胞内DNA-蛋白质之间的相互作

通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作

用蛋白的编码基因

分析鉴定细胞中转录调控因子(一种蛋白

质)与顺式作用元件(一种DNA)相互作用


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酵母单杂交系统的基本原理

转录激活结构域AD

转录因子

顺式元件

顺式元件

顺式元件

最基本启动子

报告基因

结构

顺式元件在启动子上游,报告基因在启动子下游

过程

转录因子与顺式元件结合,激活最基本启动子,使报告

基因表达

接入三个以上的顺式作用元件,可增强转录因子的

识别和结合效率


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酵母单杂交系统的应用

确定某个DNA分子与某个蛋白质之间的相

互作用

分离编码结合在顺式作用元件或其他DNA

位点的功能蛋白的编码基因

验证反式作用因子的DNA结合结构域

准确定位参与特定蛋白质结合的核苷酸序


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酵母单杂交系统的应用

从拟南芥cDNA文库中筛选出能与DRE结合的转录调控因子

拟南芥cDNA插入片段

PADH1

GAL4AD

TADH1

LEU2

转化

DRE

DRE

DRE

最基本启动子

LacZ

DRE

URA3

筛选

挑选阳性克隆

测序,进一步验证活性

阳性克隆


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


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酵母双杂交系统

利用真核生物转录调控因子的组件式结构

特征

DNA结合结构域bindingdomain,BD

转录激活结构域activatingdomain,AD

BD能与启动子结合,不能激活转录

BD和AD形成的杂合蛋白,能激活转录


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酵母双杂交系统

只有转录激活域AD不

能激活报告基因表达

只有转录结合域BD不

能激活报告基因表达

AD和BD同时存在时,

才能激活报告基因表达


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酵母双杂交系统

BD

AD

Bait

DNA结合域

DNA转录激活域

诱饵

Prey猎物


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


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蛋白质分析技术

等离子表面共振技术

免疫共沉淀技术

GST融合蛋白沉降技术

荧光共振能量转移法


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等离子表面共振技术

将诱饵蛋白结合于葡

聚糖表面,将葡聚糖固

定在纳米级金属膜表面

当有蛋白质混合物经

过时,如果有蛋白质同

诱饵蛋白发生作用,两

信号输出

诱饵蛋白

葡聚糖层

纳米级金属膜

光感受器

光源

棱镜

者结合使金属膜表面的

折射率上升,从而导致

共振角度的改变

共振角度的变化与捕

被捕获的

待分析物

自由的

待分析物

液流通路流向

获的蛋白浓度呈线性关


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免疫共沉淀技术

将蛋白抗体基质复合体加入

含有不同组分的蛋白质溶液中

固体基质

特异性抗体

2

1

亲和试剂

与抗体特异

结合的蛋白质

结合后被共沉淀到

试管的底部


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GST融合蛋白沉降技术(1)

GST谷胱甘肽转移酶;GSH谷胱甘肽

利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球的亲

和性,从混合蛋白质样品中纯化得到相互作

用蛋白

应用

确定探针蛋白和未知蛋白的相互作用

确定探针蛋白和某个已知蛋白之间的相互作用


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GST融合蛋白沉降技术(2)

SDS-PAGE

分析

谷胱甘肽琼

脂糖球珠

35S标记细

胞裂解物

发生相互作用的蛋白

GST融合物

GST


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荧光共振能量转移法(FRET)

荧光供体探针荧光受体

荧光

Taqman探针

荧光供体荧光受体

探针

分子信标

荧光


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荧光共振能量转移法(FRET)

21世纪初发现,又称长距离能量转移

是荧光能量供体与受体之间通过偶极-偶极

耦合作用以非辐射方式转移能量的过程

条件

供体与受体距离合适(1-10nm)

供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重

供体与受体的偶极具有一定的空间取向


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FRET


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


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染色质免疫共沉淀技术

chromatinimmunoprecipitation,ChIP

新发展的研究活体细胞内染色质DNA与蛋白

质相互作用的技术

主要实验流程

活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物

用超声波或酶处理将其随机切断为一定长度的染色

质小片段

利用抗原抗体反应,沉淀复合体,富集与目的蛋白

结合的DNA片段


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利用甲醛使DNA

和蛋白质交联

将DNA转移到干净

离心管中,备用

破碎细胞,

切DNA

加入蛋白酶,解除

DNA-蛋白质交联

加入感兴趣的抗体

捕获抗体结合的

DNA-蛋白质复合物


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

酵母单杂交系统

酵母双杂交系统

蛋白质分析技术

染色质免疫共沉淀技术

RNA干涉技术

基因芯片及数据分析


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RNA干涉技术

RNAinterference,RNAi

1998年安德鲁·法尔在1998年Nature上发

表了该技术

利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内

同源mRNA从而阻断靶基因表达,使细胞出

现靶基因缺失的表型

对线虫注射外源双链RNA可诱发与之高度

同源的基因序列的特异性“沉默”


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RNAi

多步骤过程

对触发物的加工

与目标mRNA的结合

目标mRNA的降解

双链RNA是RNAi的触发物,引发与之互补

的单链RNA的降解


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RNAi过程

对触发物的加工

Dicer(一种核酸酶)将细胞中长的外源双链RNA

降解成21-25bp的小分子干扰RNA(siRNA)

与目标mRNA的结合

siRNA与目标mRNA结合

目标mRNA的降解

siRNA的反义链指导合成”RNA诱导的沉默复合体

(RISC)的核蛋白体”

RISC介导切割mRNA中与siRNA反义链互补的区

域,从而干扰靶基因表达


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RNAi技术

外源双链RNA

Dicer

siRNA

细胞内mRNA

RISC切割

细胞内mRNA

干扰靶基因表达


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RNAi技术的应用

非哺乳动物

可利用较长的dsRNA直接诱导RNAi, 无需专门

合成siRNA

将目的基因体外转录得到需要的dsRNA

通过浸泡、注射或转染靶细胞实现RNAi

哺乳动物

较长的dsRNA会导致非特异性基因沉默,只有

21-25bp的siRNA才有效


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

基因芯片及数据分析

基因芯片技术原理

基因芯片的点制过程

基因芯片数据分析


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基因芯片DNAchip

传统的实验方法如RT-PCR、Northern印

迹法研究时,受电泳泳道数量的限制,每次

只能研究很少量的基因

基因芯片能同时检测大量靶基因表达,迅

速准确地在基因组水平上阐述各种转录物的

变化规律


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基因芯片技术的研究过程

用机械臂把大量已知或未知序列的DNA片

段点在玻璃片(2cm*2cm)、金属片或尼

龙膜上,经过物理吸附或化学合成达到固定

将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交,

经过计算机扫描

五个步骤:生物学问题、样品制备、生物

化学反应、检测、数据模型分析


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基因芯片技术流程图

处理组

杂交

对照组

芯片上某些点能够

与荧光标记的cDNA

发生杂交,所发出的

荧光信号与基因表达

的丰度成正比

mRNA提取

荧光染料

标记cDNA

通过比较芯片上的

激光激发

每个位置的荧光强度

来确定基因丰度或表

达强度

芯片结果


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

基因芯片及数据分析

基因芯片技术原理

基因芯片的点制过程

基因芯片数据分析


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基因芯片的点制过程:简易基因芯片

不超过2000个基因

步骤与原理中描述相同

研究小部分特定基因的表达状态

手工制样或机械臂点样


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基因芯片的点制过程:大规模基因芯片

大于10000个基因

点样方式:接触式、非接触式、半导体技术

过程

大规模PCR得到独立cDNA片段

用机械臂点样

从不同组织、器官或细胞分离mRNA,反转录成cDNA

用不同荧光染料标记不同cDNA样本

杂交

激光扫描芯片杂交结果,分析


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目录

蛋白质及RNA相互作用技术

基因芯片及数据分析

基因芯片技术原理

基因芯片的点制过程

基因芯片数据分析


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基因芯片数据分析

数据可靠性分析

重复试验以确保数据的准确

加上持家基因做内对照

生物学意义分析

差异表达基因的生物学意义

统计每条生物化学途径中固有的基因数量和被基因

芯片定位的差异表达的基因数量,计算出特定器官

或发育阶段表达有显著差异的代谢途径


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小结

蛋白质相互作用

酵母单杂交、酵母双杂交、等离子表面共振、

GST融合蛋白、免疫共沉淀技术、FRET

RNAi技术

基因沉默

基因芯片

制备过程、用途


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