생명과학실험 III 보고서 ( 결과 + 예비 )

생명과학실험III보고서(결과+예비) 생명과학과 생명과학실험 III 2004422021 양창민 2009.05.17

생명과학실험III보고서(결과) 생명과학과 생명과학실험 III 2004422021 양창민 2009.05.17

Result (사진) 5:5 (Ether : Acetone)

Result (Rf값)

Discussion • Q:색소들의 최적의 분리 비율은 얼마인가? • A:7:3 (Ether : Acetone) 의 비율이 가장 분리가 잘되어 진것으로 결과가 나왔습니다. • Q:전개용매에 따른 분리의 차이 • A: 에테르와 아세톤의 기본적인 차이 중에 하나인 극성과 비극성의 차이를 이용한 크로마토그래피 에서 그 비율이 너무 한쪽으로 치우치거나 적정 비율이 맞지 않는다면 분리가 덜 되는데 이는 색소 마다 다르다. 그래서 대표적인 예로 시금치의 경우는 9:1을 사용한다. • 이번 실험은 지난 실험과 달리 실험 도중에 색소의 움직임이 뚜렷하게 보이지 않아서 조금 더 신경을 써야 했고 지난 실험에서 과도하게 아세톤을 이용하여 시료의 농도가 낮아서 실험결과가 좋지 않게 나온 것 때문에 더 신경을 써서 했지만 육안으로 자세하게 보아야 색깔의 차이가 희미하게 보였으나 365nm 자외선 하에서 관찰을 할 때에 그 차이가 확연하게 보인 것으로 보아 이것은 그 색소자체가 광합성을 할 때에 자주 이용하는 파장인 것이라고 가정이 되어진다. 혹은 그 파장 하에서 드러나는 것으로 보아 그 파장에서 광합성이 전혀 이루어 지지 않을 수도 있다라고 가정이 되어진다. • 기타 다른 방법으로 검출할 수 있는 방법으로는 발색 시약을 뿌리거나 방사능 물질의 경우 방사능을 주사하여 관찰이 가능하게 한다. TLC의 경우는 생체조직 실험에도 사용이 된다.

Reference http://user.chol.com/~hl5nol/thin.htm http://blog.naver.com/lyceum1000?Redirect=Log&logNo=40029054560 http://kin.naver.com/detail/detail.php?d1id=11&dir_id=110204&eid=XssgGYb6YAZnlHpFgjF1yJyG6tYh6E+f&qb=7JeQ7Yu47JeQ7YWM66W0&enc=utf8&pid=fm61hwoi5UNssviL0Lhsss--271246&sid=ShKJyGt3EkoAAHqcEEI http://100.naver.com/100.nhn?docid=111187 http://kin.naver.com/detail/detail.php?d1id=11&dir_id=110204&eid=0JvmvjGLg5haNHpW6aza+h8zRMrikTh1&qb=7YGs66Gc66eI7Yag6re4656Y7ZS867aE66as7LCo7J20&enc=utf8

생명과학실험III보고서(예비) 생명과학과 생명과학실험 III 2004422021 양창민 2009.05.17

식물 유전체 DNA 개요 • 식물의 유전체 DNA는 서던블롯 분석법(Southern blot analysis), 유전체 도서관(genomic library) 제작 및 유전체 PCR 등에 필수적으로 사용된다. 지금까지 식물체에서 DNA를 분리하는 여러 방법들이 개발되었는데 식물체에서 DNA를 분리하는 과정은 기본적으로 1)식물체 분쇄, 2)세포 용해(Cell lysis), 3)용해된 세포에서의 DNA 추출 등의 단계로 이루어진다. • 대개의 실험에서는 주위에서 간단히 구할 수 있는 식물체를 이용하여 식물의 유전체 DNA 를 2시간 정도의 실험시간 내에 추출하는 방법을 사용했다. 이 방법은 델라포타(Dellaporta)등 (1983)과 머레이(Murray)와 톰슨(Thompson, 1980) 에 의해 개발된 식물 DNA 추출방법을 개량한 것으로써, 간단한 시약 및 용액으로 비교적 빠른 시간 내에 DNA를 분리할 수 있으며, 또한 식물체 A 분리에 흔히 사용되는 페놀과 클로로포름 과 같은 독성물질을 사용하지 않는 단순한 방법이다. 이 방법으로 얻어진 DNA 는 여러종류의 다당류나 페놀 복합체와 같은 불순물을 완전히 제거하기는 어려우나, PCR과 기타 효소처리를 하기에 충분한 정도의 순도를 가진다. 그러나 유전체 도서관 제작과 같은 고순도의 DNA 를 필요로 할 때는 CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide) 완충액이나 단백질 가수효소 K 완충액을 사용한 방법 혹은 상업용으로 개발된 여러종류의 식물 유전체 DNA추출용 kit를 사용하는 것이 바람직하다.

Bio Reagents and Chemicals • Reagents needed • CTAB buffer • 2% CTAB 20gm CTAB • 20mM EDTA 40ml EDTA stock (0.5M) • 100mM Tris-Cl pH 8.0 100ml Tris-Cl stock (1M) • 1.4M NaCl 280ml NaCl stock (5M) • make up to 1 Litre with water, • pH 7.5 - 8.0, and autoclave + 0.2% Mercaptoethanol • Wash Buffer • 76% Ethanol • 10mM NH4 A

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Plant DNA Extraction 1. Preheat 5ml CTAB (add 10µl mercaptoethanol to each 5ml CTAB) in a blue-topped 50ml centrifuge tube at 60-65℃. Remove and discard midribs, and wrap laminae in aluminium foil and freeze in liquid nitrogen. 0.5 – 1.0 gm tissue/5ml CTAB (Can store leaf material after liquid Nitrogen – 1-2 days at –20 or –80 for longer periods) 2. Gently crumble leaf tissue over cold pestle of liquid nitrogen. Grind frozen leaf with one spatula of fine sand add 0.5 spatula of PVPP powder after grinding. 3. Scrape powder into dry tube and add pre-heated buffer and mix gently. Avoid leaving dry material around rim of tube. Adjust CTAB volume to give a slurry-like consistency, mix occasionally. 4. Incubate for 60 min at 60℃ 5. Add equal volume of chloroform/iso-amyl alcohol (24:1), Mix for about 3min, then transfer contents to narrow bore centrifuge tubes. Balance by adding extra chlor/iso. Spin 5,000rpm for 10min (ensure correct tubes used), brake off. (For extra pure DNA isolation - spin and retain supernatentbefore chloroform extraction).

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Plant DNA Extraction 6. Remove supernatant with wide-bore pastette (cut off blue tip) to clean tube, repeat chloroform extraction once. Supernatent should be clear, though may be coloured. 7. Precipitate DNA with 0.66 vol. of cold isopropanol - can leave overnight. Spool out or spin down DNA, 2min at 2,000rpm. 8. Transfer to 5ml wash buffer for 20min. 9. Dry briefly and resuspend in 1ml T.E. (can be left overnight) 10. Add 1µl 10mg/ml RNAse to each 1ml T.E./DNA mixture and incubate for 60min at 37℃. (If RNASe in the sample doesn’t matter – stages 11 and 12 may be omitted) 11. Dilute with 2 volumes T.E. and add 0.3vol 3M Sodium acetate (pH 8) + 2.5 vol cold 100% ethanol, 12. Spool DNA out. Air dry and resuspend in in 0.5 to 1ml T.E. (takes time) and freeze until required

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) Plant DNA Extraction CTAB method 순서의 요약. CTAB 의 구조식

Cautions for using regent • CTAB method 에서 Mercaptoethanol을 나중에 넣어주는 이유는 Mercaptoethanol이 휘발성이 강하여서 먼저 넣어주었을시 공기 중에 날아갈 수 있으므로 마지막에 조심해서 넣는다. • Mercaptoethanol은 산화 방지제로서 Nucleotide의 산화를 방지해준다. • CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 핵산(nucleic acids)하고 결합해서 nucleic acid-CTAB complex 를 만들고, 원심분리를 하게 되면 nucleic acid-CTAB complex 가 침전하게 된다.이 nucleic acid-CTAB complex 침전을 모아서 resuspend한 후 ethanol 을 이용해서 핵산만 침전시킨 후 ribonuclease로 처리하면 순수한 DNA를 얻는다보통 plant cell 에서 DNA를 분리할 때 쓴다. • 에탄올이나 아이소프로판올은 둘 다 uncharged 물질인데,DNA는 - charge가 있는데, 이게 그냥 물에다 놓으면 잘 침전이 안되는 이유는 물에 잘 녹기 때문입니다. 그래서 에탄올이나 아이소프로파놀 같은 것을 넣어줘서 물에 대한 친화력을 떨어뜨려서 centrifuge로 침전시킬 때 잘 침전이 될 수 있도록 도와주는 것이다. • -20'C에서 냉장보관해서 써야 하는 이유는 . 70% 에탄올은 보통 냉장보관 시 얼지 않고이 에탄올 solution내 있는 DNA을 안정적으로 오랫동안 보관하기 위해서 이런식으로 냉동보관 하는 것이다.대게 -20'C 이렇게 하지만 오랫동안 보관하려 할 때는 -70'C 로 보관을 하는데,이렇게 하면 몇 년을 보관해도 DNA의 손상이 거의 없다고 보면 되고DNA를 그냥 상온에 보관하면 서로 부딪치던가 해서 파괴될 수가 있는데 이것을 막기 위해서 냉동보관을 하는 것이다.

Reference http://kin.naver.com/detail/detail.php?d1id=11&dir_id=110205& eid=G0iZaXWaE6C8ONR04Sk3p3lm9MN0PObo&qb=Y3RhYg==&enc=euc-kr&order=3 http://en.wikipedia.org/wiki/Hexadecyltrimethylammonium_bromide http://blog.naver.com/hongyifan78?Redirect=Log&logNo=60050111735 03학번 이성남 선배(서울여대 박사과정)에게 질문을 통해 받은 답. http://en.wikipedia.org/wiki/File:Cetrimonium_bromide.png 유전학실험서 (라이프 사이언스출판 한국유전학회 지음 P.129)

생명과학실험 III 보고서 ( 결과 + 예비 )

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