Elektronska mikroskopija

1. Elektronska mikroskopija Principi elektronske mikroskopije Tehnike elektronske mikroskopije Prvi elektronski mikroskop je konstruisan u Nemačkoj u periodu između 1928-1934. Širabiološka primena počinje početkom pedesetih godina.

2. ↔ Uveličanje Rezolucija Elektronska mikroskopija Svetlosni Osnovni princip: umesto vidljive svetlosti i optičkih sočiva, za dobijanje uveličane slike objekta kod elektronskog mikroskopa koristi se snop elektrona koji se usmerava i fokusira uz pomoć elektromagnetnog polja.

4. Veće uveličanje Veća rezolucija Veća rezolucija Veće uveličanje Elektronska mikroskopija Rezolucija (razdvojna moć ) – najmanje rastojanje između dve tačke pri kome se one raspoznaju kao razdvojeni objekti. Rezolucija je određena talasnom dužinom “osvetljavajućeg “ snopa. Maksimalna teoretska rezolucija je oko polovine talasne dužine snopa koji pada na objekat. Kod svetlosnog mikroskopa za osvetljavanje objekta se koristi snop vidljive svetlosti (400-700 nm)  najbolja rezolucija do 200 nm.

5. Detalji objekta koji se posmatra ne mogu se raspoznati ako su manji od talasne dužine osvetljavajućeg snopa – zbog pojave difrakcije i interferencije  senka. Interferencija Difrakcija Difrakcija crvene svetlosti je veća i nakon prolaska kroz dva odvojena objekta dolazi do prepoklapanja – interferencije - senka daje utisak jednog objekta Difrakcija plave svetlosti je manja i nakon prolaska kroz dva odvojena objekta dolazi do manje interferencije - senka daje utisak dva odvojena objekta

6. Elektronska mikroskopija De Broglie-v zakon: čestice koje se brzo kreću (brzinom svetlosti) imaju osim korpuskularne i talasnu prirodu. Talasna dužina ovih čestica: λ = h / m v me = 9.11 × 10−31 kg h = 6.63 ×10−34 J s Da bi se mogao raspoznati objekat veličine 10−9 m (1 nm), potrebno je na njega usmeriti elektrone koji će imati brzinu približno 100 000 m s−1). Ubrzavanje elektrona do potrebnih brzina za ovu svrhu zahteva veliki napon (50 - 100 000 V). Elektron pri ovom naponu ima talasnu dužinu od 0.55 (0.39) nm. Teškoće: fokusiranje elektrona  ne može staklenim sočivima, već magnetnim kalemovima. Mora postojati jak vakuum da se spreči rasipanje elektrona i jonizacija molekula vazduha.

7. Elektronska mikroskopija Za biološke uzorke stvarna granica rezolucije obično nije manja od 2 nm, zbog problema s pripremom preparata i kontrastom. Elektronski mikroskop ima oko 100 puta veću razdvojnu moć od svetlosnog mikroskopa. Uz ovakvu rezoluciju i veće uvećanje (do 100 000 puta), elektronski mikroskop ima velike prednosti u odnosu na svetlosni (koji ima maksimalno uvećanje od 1000 do 1500 puta).

8. Provodni snopić na svetlosnom mikroskopu Provodni snopić na SEM Biljna vlakna na TEM Elektronska mikroskopija Tehnike • TEM – Transmisiona elektronska mikroskopija – daje sliku KROZ objekat (uzorak u obliku tankog preseka). • SEM – Skening elektronska mikroskopija – daje sliku POVRŠINE objekta.

9. Elektronska mikroskopija U obe tehnike primenjuju se elektronski zraci, ali za stvaranje slike se koriste različiti mehanizmi: TEM oblikuje sliku pomoću elektrona koji se propuštaju kroz preparat. SEM skenira površinu preparata - sliku oblikuje detekcijom elektrona koji se odbijaju od spoljašnje površine preparata – daje utisak dubine (3D). SEM SEM TEM TEM Neuroni Ćelijske organele

10. Elektronska mikroskopija U obe tehnike primenjuju se elektronski zraci, ali za stvaranje slike se koriste različiti mehanizmi:

11. TEM Elektronski top Kondenzorsko sočivo Uzorak Objektivsko sočivo Projektorsko sočivo Fluorescentni ekran Elektronska mikroskopija Osnovni delovi su smešteni unutar glavne mikroskopske kolone – metalnog cilindra u kome je vakuum: - elektronski top - kondenzorsko sočivo - mesto za uzorak - objektivsko sočivo - projektorsko sočivo - fluorescentni ekran - fotografska ploča

12. Elektronska mikroskopija Delovi elektronskog mikroskopa Elektronski top:izvor elektrona katoda - užarena volframova nit. Neki el. mikroskopi koriste elektrone emitovane iz katode koju čini užareni kristal lantan-heksaborida šiljastog oblika presvučen slojem cirkonijum-oksida. Primenom ovog elektronskog topa može se dobiti vrlo uzan snop elektrona, što određuje visoku rezoluciju mikroskopa. Katoda Anoda Elektronski top – izvor elektrona TEM

13. Elektronska mikroskopija Delovi elektronskog mikroskopa Emitovani elektroni ubrzavaju se prema anodi koja ima funkciju propuštanja elektrona tačno definisanih energija. Elektronski snop fokusira se sistemom elektromagnetnih sočiva(kalemova) smeštenih u središnjemu delu mikroskopske kolone. Otklon snopa omogućuju elektromagnetnikalemovi smešteni pri dnu mikroskopske kolone. EM – elektronskaoptika (i za X zrake)

14. Elektronska mikroskopija Delovi elektronskog mikroskopa Kondenzorsko sočivo: za širenje elektronskog snopa i usmeravanje struje na uzorak. Objektivsko sočivo: za izoštravanje – promenom jačine struje. Projektorsko sočivo:za regulaciju uveličanja. Promenom jačine struje u njemu, fokusna tačka se pomera gore-dole duž optičke ose. Fluorescentni ekran: emituje svetlost pod uticajem elektronskog bombardovanja (cink-sulfid itd.). Fotografska ploča: ispod fluorescentnog ekrana, za kasniju analizu. Vakuumski sistem - pumpe: obezbeđuje vakuum u koloni čime se obezbeđuje veća prodornost elektrona u koloni i onemogućuje jonizacija molekula vazduha. Sistem za hlađenje pumpi i sočiva. TEM

15. TEM Osnovna elektron – optička konfiguracija Najmanje četiri (najčešće pet) sočiva za stvaranje slike je neophodno. Potrebna su i dva kondenzorska sočiva. Elektronska mikroskopija

16. Elektronska mikroskopija Priprema uzoraka za TEM Uzorak za analizu mora biti u obliku tankog preseka (<100 nm), da bi elektroni primarnog snopa mogli prolaziti kroz preparat. Takođe, mora biti obezbeđen dodatni kontrast – tretman oblaganja teškim metalima koji se selektivno vezuju za specifične strukture u uzorku.

17. Elektronska mikroskopija Priprema uzoraka za TEM Elektroni primarnog snopa različito prolaze kroz preparat, zavisno od same gustine objekta, a delovi uzorka za koje su vezani atomi teških metala će potpuno skretati elektrone. Na osnovu gistine propuštenih elektrona kroz objekat, projektuje se slika uzorka na ekranu - fluorescentna ili digitalna obrada. TEM se uglavnom koristi za anlizu unutrašnjih struktura objekata – ćelijskih organela, za vizualizaciju kontura intaktnih i veoma malih objekata, virusa, ili molekulskih agregata.

18. Elektronska mikroskopija Priprema uzoraka za TEM Zbog niske prodorne snage elektrona, uzorci koji se pripremaju za elektronsko mikroskopiranje moraju biti izuzetno tanki. Instrument koji se koristi za tu svrhu naziva seultramikrotom - opremljen je dijamantnim nožem - može seći preseke debljine do 20 nm. Deblji preparati se takođe mogu prosmatrati transmisionim elektronskim mikroskopom, ali je u tom slučaju potreban znatno veći pogonski napon kako bi se povećala prodorna snaga elektrona.

19. Elektronska mikroskopija Priprema uzoraka za TEM Fiksacija.Uzorak tkiva mora biti zaštićen od promene strukture. Fiksativi: Osmium tetraoksid (OsO4) – učvršćuje membrane; Glutaraldehid – fiksira proteinske komponente. pH. Fiksacija sprečava oksidativnu degradaciju uzorka tokom sušenja. Bojenje. Organele koje su od interesa za proučavanje moraju imati dovoljnu elektronsku gustinu zbog kontrasta prema podlozi. Veliku elektronsku gustinu imaju teški metali, kojih ima malo u tkivu. Stoga se preparat boji rastvorima teških metala – osmium tetraoksid, uranil acetat, olovo citrat. Dehidratacija – sušenje.Voda iz uzorka bi u vakuumu isparila i ometala elektronski snop. Uzorak se oslobađa vode potapanjem u rastuće koncentracije etanola (70% do 100%). Kalupljnje.Dehidratisan uzorak se uranja u materije koje sadrže smole (epoksi- ili akrilne monomere). Vezivanje smole za uzorak se vrši toplotom, UV, hemijskim materijama. Sečenje preparata. Uzorak u plastičnom bloku seče se uz pomoć ultramikrotoma. Debljina preparata (do 100 nm), treba da omogući prolazak elektrona kroz preparat.

20. Elektronska mikroskopija Specifične tehnike u elektronskoj mikroskopiji Tehnika negativnog bojenja-uzorci se ne seku na ultratanke preseke već se odlažu u gustu elektronsku boju (uranil acetat) → netaknuti preparat daje sliku izdvajajući se od tamno obojene pozadine. Ova je tehnika je primenljiva isključivo za vrlo male objekte – virusi, bakteriofage, izolovane organele, makromolekuli, DNA, RNA,molekulski agregati... Bakteriofage

21. Elektronska mikroskopija Specifične tehnike u elektronskoj mikroskopiji Frakturiranje (lomljenje) zamrzavanjem- uzorci se podvrgavju naglom zamrzavanju – obično u tečnom azotu, a onda se udaraju oštrim sečivom. Ovo uzrokuje lomljenje (frakturu) preparata po linijama prirodne slabosti, što su u većini slučajeva prazni prostori u membranama. Tanki sloj metala (zlato, platina) se tehnikom "zasenjivanja" nanosi na površinu uzorka stvarajući kopiju preparata. Kopija se potom proučava na EM. Iz razloga što linija loma prolazi kroz prazne prostore u membranama, kopija nastala ovim postupkom je odraz unutrašnjosti membrana.

22. Elektronska mikroskopija Specifične tehnike u elektronskoj mikroskopiji Imuno-gold bojenje – za identifikaciju proteina na TEM. Tanki preseci uzoraka se inkubiraju sa primarnim antitelima specifičnim za analiziran antigen. Koriste se sekundarna antitela obeležena zlatnim koloidnim česticama za bojenje primarnih antitela.

23. Elektronska mikroskopija SEM

24. Elektronska mikroskopija SEM Za pregledanje i analizu površine čvrstih uzoraka. Rezolucija je najčešće 10 nm, a uveličanje 20 000 puta. Dobija se 3D slika uzorka.

25. Elektronska mikroskopija Slike dobijene na SEM

26. Stoma (2900x) Elektronska mikroskopija Slike dobijene na SEM

27. SEM Elektronski top Kondenzorska sočiva Regulacija skeniranja-navoji Objektivska sočiva Uzorak na nosaču Detektor sekundarnih elektrona Detektor X-zraka Elektronska mikroskopija Skeniranje površine se ostvaruje prelaženjem uskog snopa (primarnih) elektrona preko površine uzorka. U svakoj tačci uzorka u interakciji elektrona primarnog snopa i molekula (atoma) uzorka dolazi do stvaranja “signala” koji se detektuje. Signal se mapira na video ekranu – svaka tačka interakcije odgovara posebnoj slici na ekranu. Oštrina slike zavisi od jačine signala sa uzorka (energija sekundarnih elektrona).

28. Elektronska mikroskopija SEM

29. SEM Elektronska mikroskopija Primarni elektronski snop se fokusira na uzorak (prečnik ispod 10 nm) i prelazi tačku po tačku, liniju po liniju. Interakcija primarnog el. snopa i uzorka  signal: -sekundarni elektroni -odbijeni elektroni - Auger elektroni - apsorbovani - propušteni - katodoluminescencija - X - zraci Površina lista (1300x) Uveličanje: površina uzorka za analizu određena je veličinom primarnog el. snopa (10 nm), a signal se prenosi na monitor znatno veće površine  uveličanje nekoliko desetina hiljada puta

30. Elektronska mikroskopija Priprema uzoraka za SEM Sušenje – na specijalan način da uzorak ne bi promenuo oblik. U tečnom CO2 (češće nego u alkoholu). Sušenje - smrzavanje – lomljenje – za analizu unutrašnjih struktura, naročito membrana. Prevlačenje slojem metala – uzorak mora provoditi struju. Preparat se prevlači atomima zlata (platine) u sloju debljine od 2nm  sprečavanje akumulacije naelektrisanja u EM i erozije izorka. Efekat senke.

31. Elektronska mikroskopija Priprema uzoraka za SEM Pesvlačenje uzorka zlatom (platinom) Uzorak se stavlja u komoru, na provodnik od ugljenika u atmosferu od inertnog gasa argona (Ar). Katoda- omotač komore je od zlata i služi za oblaganja uzorka ovim metalom. Kada se elektrode prikluče na jak napon, argon će se jonizovati. Joni Ar+ će udarati u katodu i izbijati atome Au koji će oblagati uzorak.

32. Elektronska mikroskopija Priprema uzoraka za SEM

34. Elektronska mikroskopija SEM Sliku daju sekundarni elektroni koji su dislocirani – izbačeni sa površine skeniranog uzorkanakon bombardovanja od strane primarnog el. snopa. Sekundarni elektroni dolaze do detektora (pozitvnog naelektrisanja) gde se indukuje električni signal koji se pojačava i digitalizuje. Rezultat – na ekranu se pojavljuje topografska slika površine ispitivanog objekta-površina metalnog omotača objekta. Osim sekundarnih elektrona i drugi oblici emisije sa uzorka (X zraci, katodo-luminescencija, reflektovani elektroni itd.) mogu se skupljati i analizirati od strane specifičnih detektora.

37. Elektronska mikroskopija Ako je potrebno jasno videti objekte međusobno udaljene manje od 100 nm (rezolucija),mora se primeniti analiza elektronskim mikroskopom.