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福建师范大学、福建省农业科学院 二〇一三年一月 七 日

福建师范大学、福建省农业科学院 二〇一三年一月 七 日. 青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹图谱 多态性研究. 导 师：刘 波 博 士、研究员 报告人：代升飞 学 号：20111005. 报告内容. 一 研究背景 二 研究现状与趋势 三 研究目的 四 研究内容与方法 五 研究创新点. 一、 研究背景. 番茄. 辣椒. 青枯病是由青枯雷尔氏菌（ Ralstonia solanacearum ）引起的一种世界性的土传细菌性病害，目前对其 致病机制尚无定论. 一、 研究背景. 强菌株.

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福建师范大学、福建省农业科学院 二〇一三年一月 七 日

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Presentation Transcript

  1. 福建师范大学、福建省农业科学院 二〇一三年一月七日 青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹图谱 多态性研究 导 师：刘 波 博 士、研究员 报告人：代升飞 学 号：20111005

  2. 报告内容 一 研究背景 二 研究现状与趋势 三 研究目的 四 研究内容与方法 五 研究创新点

  3. 一、研究背景 番茄 辣椒 青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种世界性的土传细菌性病害，目前对其致病机制尚无定论

  4. 一、研究背景 强菌株 • 青枯雷尔氏菌根据致病力的情况可以分为强致病力菌株和弱致病力菌株，胞外蛋白分泌较多 • 弱致病力的青枯雷尔氏菌可以侵染植株，诱发植株自身免疫抗病，不引起植株发病，胞外蛋白分泌较少 弱菌株

  5. 一、研究背景 • 青枯雷尔氏菌合成大概10种主要的胞外蛋白（exoprotein），在实验室青枯雷尔氏菌发酵液上清液中可轻易地检测到这些蛋白 • 有些胞外蛋白的生产量很少，其产生条件也不尽相同，但正是由于这些微量蛋白之间的相互协同作用，对青枯雷尔氏菌引起植株发病起着不可或缺的作用

  6. 二、研究现状与趋势 • 强致病性、过渡态和无致病性青枯雷尔氏菌 • 20-50 KDa范围内，弱致病性青枯雷尔氏菌胞外分泌蛋白少于强致病性和过渡态菌株

  7. 二、研究现状与趋势 • 目前对于胞外蛋白定位的机理各不相同 • 抗病信号物质在抵御病原入侵的过程中起着重要作用，它们所介导的信号途径与植物抗性密切相关 • 有信号序列、无信号序列蛋白的胞外分泌 • 研究青枯雷尔氏菌胞外蛋白，建立特征图谱，为开发一些新型的、高效的生态农药奠定基础

  8. 二、研究现状与趋势 • 1984-1985年，Chen WY、Tsai J W 等发现毒素与青枯病有关 • 1992年，Lory S 等研究了革兰氏阴性菌分泌胞外蛋白的决定因素 • 2004年，MITSUOH等人从分子生物学的角度研究青枯病的分类 • 2011年，彭文舫等采用分子手段，分析抗青枯病基因

  9. 三、研究目的 1.掌握植物病原菌胞外蛋白分析技术 2.构建青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹图谱 3.探究植物病原细菌毒素的致病机理

  10. 四、研究内容与方法 1、青枯雷尔氏菌胞外蛋白分析技术的建立 1.1 不同致病力青枯菌发酵液的制备 1.2 胞外蛋白的提取 1.3 SDS-PAGE凝胶电泳构建指纹图谱 2、不同致病力青枯雷尔氏菌胞外蛋白差异性分析 2.1 GC-MS条件优化 2.2 GC-MS分析 3、青枯雷尔氏菌毒素蛋白的提取及作用机理 3.1 乙醚萃取 3.2 生物活性检测分析 4、番茄青枯病植物疫苗菌株发酵过程胞外蛋白分析及发酵条件的优化 4.1不同pH梯度下相关指数分析 4.2不同氯化钠浓度下相关指数分析

  11. 四、研究内容与方法 技术路线

  12. 四、研究内容与方法 1.实验方法-SDS-PAGE凝胶电泳技术的优化 发酵液 上清液 5×上样 缓冲液 12%分离 胶的制备 5%浓缩胶 的制备 样品的 制备 胶的制备 SDS-PAGE 凝胶电泳 银染法 考G250 染色 考R250 染色 最优方法

  13. 2.实验方法-HPLC-MS/MS条件优化 四、研究内容与方法 电离电压 导入电压 雾化气流 干燥气流 质谱条件优化 GC-MS分析

  14. 四、研究内容与方法 3.实验方法-毒素蛋白的提取 不同致病力 青枯雷尔氏菌 甲醇 55 ℃左右 旋转蒸发 乙醚萃取 40℃旋转蒸发 青枯雷尔氏 菌毒素蛋白 离心 不同寄主 青枯雷尔氏菌 作用机理

  15. 2.实验方法-青枯菌植物疫苗发酵条件优化 四、研究内容与方法 pH值 氯化钠浓度 培养时间 发酵条件优化 发酵过程中的参数变化

  16. 五、选题的创新点 采用SDS-PAGE 凝胶电泳构建青枯雷尔氏菌胞外蛋白指纹图 谱和生长过程中指纹图谱的变化，并用GC-MS分析青枯雷尔氏菌 上清液的物质组成以及与毒素的关系、生物效应等。为研制开发 环保、安全、高效的防治青枯病植物疫苗提供新的思路和方法。 从分子、蛋白的角度研究免疫抗病的代谢机制，结合毒素的 作用机理着手探究植物疫苗的新方法。

  17. 六、实验工作进度安排 • 2012年9-12月，查阅文献，了解国内外研究现状，初步确定实验方案。 • 2013年1- 3月，番茄青枯病生防菌保存条件的优化研究 • 2013年4-7月，生长过程中青枯雷尔氏菌胞外蛋白群体指纹图谱的变化研究 • 2013年8-9月，青枯雷尔氏菌胞外蛋白GC-MS 分析 • 2013年10月-2014年3月，整理数据，撰写论文。

  18. 1、本课题所用的青枯雷尔氏菌为菌种资源库保藏菌株，其生理生化特性等情况基本一致，提高了为试验结果的可靠性。1、本课题所用的青枯雷尔氏菌为菌种资源库保藏菌株，其生理生化特性等情况基本一致，提高了为试验结果的可靠性。 2、实验所需的各种设施（超净工作台、高效液相色谱、PCR仪、气质联用、高速冷冻离心机、UVP凝胶成像仪等）齐全，本实验能正常进行。 七、已具备的研究条件 研究基础

  19. 七、已具备的研究条件 仪器条件

  20. 七、已具备的研究条件 经费资助 • 国家“863”计划项目（2012AA101504）； • 国家星火项目（S2011C410006）； • 福建省公益类科研院所基本科研专项（2011R10 20-1）； • 国家公益性行业农业科研专项（201303015）

  21. Thank You !

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