1 / 23

BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation

BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation. Alba Espargaró Colomé. Protein Fragment Complementation. També anomenats: Interaction trapping. Permeten observar interacció entre proteïnes in vivo. Classes: Ubiquitina Dihidrofolat reductasa Β -galactosidasa GFP (green fluorescent protein).

allistair-mckay
Download Presentation

BIFC Bimolecular Fluorescence Complementation

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. BIFCBimolecular Fluorescence Complementation Alba Espargaró Colomé

  2. Protein Fragment Complementation • També anomenats: Interaction trapping. • Permeten observar interacció entre proteïnes in vivo. • Classes: • Ubiquitina • Dihidrofolat reductasa • Β-galactosidasa • GFP (green fluorescent protein)

  3. Detection of transient protein-protein interactions by bimolecular fluorescence complementation: The Abl-SH3 case M. Morell et al. Proteomics 2007,7,1023-1036 Estudiar en detall la habilitat del mètode BIFC per detectar interaccions transitòries.

  4. The Abl-SH3 case Domini SH3:Domini implicat en la regulació negativa de l’activitat quinasa mitjançant interaccions transitòries entre proteïnes. • C-Abl tyrosine kinase: regula diferenciació cel·lular i apoptosi, sent responsable de molts senyals extracel·lulars (factors de creixement, adhesió cel·lular i citoquines) i intracel·lulars (dany DNA, estrès oxidatiu)

  5. Interaccions estudiades • Domini SH3 interacciona amb polipèptids rics en prolina, seguint el motiu PXXP: • BRCA1: càncer de mama tipus 1 • PRDX1: peroxiredoxina • p41: pèptid ric en prolina + mutants • WT (Tyr4) • Tyr4Arg • Tyr4Phe • Tyr4Trp • Tyr4Gly

  6. Bimolecular Fluorescent Complementation

  7. C-Abl-SH3: fusionada a l’extrem C-terminal (156-238) amb un linker de seqüència SGGGSGGS i clonada en pBAT-4 (ampR) • Pèptid p41: fusionat a l’extrem N-terminal (1-155) amb un linker de seqüència SGGGS i clonat en pET28-a(+) (kanR) Transformació de cèl·lules competents d’Escherichia coli BL21(D3)

  8. Esquema basat en les estructures obtingudes per X-ray

  9. Experiments amb p41 • Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP o p-p41-NYFP individualment. Fragments individuals de YFP no són funcionals

  10. Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-p41-NYFP La majoria de les cèl·lules tenen fluorescència. • Cèl·lules transformades amb p-Abl-SH3-CYFP i p-NYFP Necessitat de dues proteïnes per la reconstitució de YFP

  11. Anàlisi de l'espectre d’emissió de fluorescència on s’observa el pic a 523 nm, l’espectre característic de la YFP nativa

  12. Estructura de Abl-SH3 interaccionant amb P41 • Pro54 i Trp36 són dos residus molt ben conservats en el domini SH3, situats en el centre hidrofòbic. • Juga un paper molt important en la interacció amb els pèptids rics en prolina. • Pro54Leu redueix significativament la unió del domini Abl-SH3 amb els lligands

  13. Contrast de fases (esquerra) i fluorescència (dreta)

  14. Western blot: • c-Abl-SH3-CYFP • C-Abl-SH3-P45L-NYFP

  15. Mutants de p41 • Construcció de 5 mutants de p41 en la posició 4 (important per la interacció amb Abl-SH3) • Trp4, Phe4, Tyr4, Arg4 i Gly4 • Es va transformar amb una barreja dels 5 a igual concentració juntament amb c-Abl-SH3-CYFP

  16. Western Blot Tyr>Arg>Phe>Gly>Trp

  17. Estabilitat de la reconstitució de la YFP Una vegada YFP està reconstituïda és molt estable

  18. Seguiment de les interaccions mitjançant citòmetre de flux • 1: control negatiu Abl-SH3-CYFP • 2: control positiu YFP • 3: Abl-SH3-CYFP + NYFP • 4: Abl-SH3-CYFP + p41-NYFP • 5: Abl-SH3-CYFP + p41-Gly4-NYFP

  19. Relació en % de Abl-SH3-CYFP+p41-NYFP / Abl-SH3-CYFP+p41-Gly4-NYFP • Negre: 20/80 • Gris fosc: 10/90 • Gris clar: 5/95

  20. Mitjançant el citòmetre de flux podem observar la presència de bons lligands encara que es trobin a una concentració molt baixa. • Citòmetre de flux és molt ràpid, altament sensible per tant una bona tècnica per avaluar les interaccions transitòries mitjançant BIFC.

  21. Conclusions • BIFC: mètode de visualització directe d’interaccions febles entre proteïnes intracel·lulars. Bon mètode per detectar interaccions fortes però també febles. • No necessita cap assaig enzimàtic per detectar la seva activitat. • L’assaig és suficientment sensible per detectar interaccions entre proteïnes que estan poc expressades en bactèria. • Una vegada els dos fragments de YFP estan units són molt estables, això pot ser la raó de l’elevada sensibilitat, ja que el complex pot emetre fluorescència durant molt temps (setmanes)

  22. Conclusions • Les diferències de fluorescència observades entre els diferents mutants de p41 determina que és un mètode capaç de diferenciar lligands d’alta i baixa afinitat. • La combinació de BIFC amb el citòmetre de flux fa que sigui un mètode ràpid, altament sensible i selectiu per determinar interaccions febles entre proteïnes • Manera fàcil d’obtenir els resultats.

  23. BIFCBimolecular Fluorescence Complementation Alba Espargaró Colomé

More Related