G énmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák

1. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása

2. A mutátor elem felépítése meghatározza a P elem mutagenezis jellegét • enhanszer csapdázás – génexpresszió, mutagenezis, klónozás • Géncsapdázás – génexpresszió, mutagenezis, klónozás • irányított génexpresszió – génfunkció vizsgálata, kölcsönhatások • epitóp jelölés – géntermékek követése és tisztítása, in vivo analízis • irányított génszupresszió – génfunkció vizsgálata, null fenotípus • helyspecifikus rekombináció- génfunkció vizsgálata, többfunkciós gének • irányított géncsere – mutagenezis, gén és protein funkció vizsgálata

3. A P-lacW enhanszer csapdázó elem felépítése Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén mini-white lacZ ori amp E B Bakteriális szekvencia a DNS klónozást teszi lehetővé Génexpresszió követését teszi lehetővé Marker gén lehetővé teszi a P elem követését P{PZ} enhanszer csapdázó elemben a rosy marker gén található a mini-white helyett

4. A patched gén közelébe inszertálódott P-lacZ elem expressziós mintázata imágókorongokban láb szárny szem

5. A P-Gal4 alapú enhanszer csapdázás mechanizmusa Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén mini-white Gal4 ori amp E B Gal4 detektálás lacZ/gfp 5xUAS

6. GFP riporter expressziója P-Gal4 enhanszer csapdázó vonalakban

7. P-lacZ P-lacZ P-lacZ P-lacZ W- Y Enhanszer csapdázó inszerciók létrehozása mutátor törzs transzpozáz forrás P(Δ2-3), Sb W- X Y TM6, Tb P(w+) P(Δ2-3), Sb W- W- X W- Y „jump-starter” hímek W- vagy Y lacZ expressziójának detektálása

8. A enhanszer csapdázás előnyei • A riporter gén expressziója speciális sejtmarkerként használható • Követhetők a sejtek az egyedfejlődés során • Egyedi identitást adhat a sejteknek olyan stádiumban, amikor morfológiailag még nem különülnek el • Gyakran nem érinti a gén funkcióját, vagy hipomorf allélt eredményez • Egyszerű mutációs analízist, és gyors klónozást tesz lehetővé

9. Az enhanszer csapdázás korlátai • Sok enhanszer csapdázó inszerció nem okoz mutációt • Nem mindig egyértelmű, hogy egy enhanszer szekvencia melyik gén expresszióját befolyásolja • Gyakran az érintett gén távol helyezkedik el az enhanszertől • Egy riporter gén aktivitását egyszerre több enhanszer szekvencia is befolyásolhatja

10. hs-neo poli-A poli-A exon1 Gal4 A kettősen jelölő pGT1 géncsapdázó elem felépítése SA SD mini-white Gal4 exon1 poli-A promóter exon2 exon3 mini-white exon2 exon3 w+ szemszín Gal4 detektálás lacZ/gfp 5xUAS

11. Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: irányított génexpresszió

12. Irányított génexpresszió a Gal4 moduláris rendszerben - 1 Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén mini-white Gal4 ori amp E B Gal4 vizsgált gén 5xUAS

13. ori amp mini-white Gal4 Irányított génexpresszió mechanizmusa -2 promóter UAS mini-white gén ori amp

14. Enhanszer csapdázás különleges esete: sejtek eliminációja Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén mini-white Gal4 ori amp E B Gal4 gyilkos gén 5xUAS ricin, diftéria toxin reaper, grim, hid tetanusz toxin

15. poli-A Az epitóp jelölés mechanizmusa SA SD mini-white GFP FRT FRT FLP rekombináz SA SD exon1 poli-A promóter GFP exon2 exon3 GFP

16. GFP epitóppal jelölt proteinek kifejeződése