ing ale prell csc mikrobiologick stav av r v v i biotechnologick hala
Download
Skip this Video
Download Presentation
Moderní způsoby kultivace

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 102

Moderní způsoby kultivace - PowerPoint PPT Presentation


  • 127 Views
  • Uploaded on

Ing. Aleš Prell, CSc. Mikrobiologický ústav AVČR, v.v.i. Biotechnologická hala. Moderní způsoby kultivace. kultivace v bioreaktorech submerzní kultivace v kapalině ( SLC ) míchané bioreaktory jednorázové kultivační vaky membránové bioreaktory kultivace na pevných půdách ( SSC )

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Moderní způsoby kultivace' - alize


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
ing ale prell csc mikrobiologick stav av r v v i biotechnologick hala
Ing. Aleš Prell, CSc.

Mikrobiologický ústav AVČR, v.v.i.

Biotechnologická hala

Moderní způsoby kultivace
modern zp soby kultivace v bioreaktorech
kultivace v bioreaktorech

submerzní kultivace v kapalině (SLC)

míchané bioreaktory

jednorázové kultivační vaky

membránové bioreaktory

kultivace na pevných půdách (SSC)

proces – dynamika, řízení, optimalizace

základní typy kultivačních procesů

optimalizace bioprocesu

moderní způsoby kultivace v bioreaktorech
slide4

BIOREAKTOR

zařízení, kde probíhá růst buněk a tvorba produktů nebo konverze substrátu na jeden či více produktů

slide5

ideální bioreaktor

rychlý přestup tepla, kyslíku a hmoty, rychlá homogenizace,

nízké provozní náklady

transport ivin a metabolit
transport živin a metabolitů
  • mezifázové rozhraní plyn-kapalina
  • transport v kapalině
  • kapalina-pevná fáze
  • transport aglomerátem
  • transport přes biologické membrány

Sj - substráty, Pj - produkty, ∆Hv - tepelná bilance

podle skupensk f ze
podle skupenské fáze
  • submerzní (suspenzní) – částice se volně vznášejí v kapalné fázi
    • míchané reaktory
    • air-lift
    • bublané kolony
  • imobilizované – buňky jsou ukotveny v pevné struktuře
    • membránové – oddělení fází či komponent systému
    • pevné lože (packed-bed) – protékání pevného nosiče
    • fluidní lože – vznáší se v proudu
  • na pevné fázi – médium v tomto uspořádání tvoří pevný povrch a buňky tvoří povlak čí nárůst
slide9

submerzní kultivace

(Solid-Liquid-Cultivation – SLC)

vs.

kultivace s imobilizací

vs.

kultivace na pevném substrátu

(Solid-Solid-Cultivation – SSC)

rozd len bioreaktor podle
rozdělení bioreaktorů podle
  • operačního módu
    • vsádkový (batch)
    • přítokovaný (fed-batch)
    • kontinuální
    • perfuzní
  • měřítka
    • laboratorní (do 30 L)
    • čtvrtprovozní (do 100 L)
    • poloprovozní (do 5000 L)
    • provozní
v b r bioreaktoru
minimalizace odparu kapaliny

tlaková odolnost

sterilita operace

čištění bioreaktoru

bezpečnost

účelová flexibilita a kompatibilita

cena zařízení a jeho provozu

přestup kyslíku a tepla jsou limitující faktory pro provoz bioreaktoru a scale-up

výběr bioreaktoru
  • přestup kyslíku
  • přestup tepla
  • přestup hmoty
  • požadavky na míchání
  • nároky na energie
  • citlivost kultury ke střižným silám
  • reologie kapaliny - viskozita média (míchání, přestup hmoty, přestup tepla, střižné síly)
kultiva n m dium
kultivační médium
  • je nezbytné pro růst a metabolismus mikroorganismů
  • tvoří vnější prostředí, které ovlivňuje chování mikroorganismu (růst, metabolismus, fyziologie)
  • ovlivňuje výtěžnost, rychlost tvorby produktu, složení produktu
  • musí obsahovat dostatečné množství živin
  • živiny – růst buněk, získání energie pro syntézu produktu a zachování buněčné integrity
z kladn typy m di
DEFINOVANÁ

známo složení

minerální soli

čisté esenciální složky

zdroj uhlíku a energie

základní typy médií
  • KOMPLEXNÍ
  • organický zdroj živin
    • hydrolyzáty proteinů (peptony)
    • extrakty masa, kvasnic
n vrh slo en m dia
návrh složení média
  • je nutno znát biochemii kultivace – vliv na metabolismus a fyziologii buněčné populace
  • účel kultivace – složení média (DSP)
  • cena (tvoří přes 50% ceny konečného produktu), stálost jeho složení
  • formulace média - kompromis mezi nutričními požadavky, cenou a dostupností složek média
  • chemické složení média – určí se ze složení biomasy a produktu, výtěžnostních koeficientů a doplňkových experimentů
funkce ivin
funkce živin
  • zdroj stavebního materiálu nebo prekurzorů pro syntézu nových buněčných součástí – sloučeniny, které se stanou součástí biomasy
  • zdroj energie - sloučeniny, které se nestávají přímo součástí biomasy, ale slouží k výrobě energie (jako donory nebo akceptory elektronů)
  • ovlivňují složení mikrobiální buňky
  • elementární složení všech mikrobiálních buněk je relativně podobné – možnost odhadu obecných požadavků MO na živiny a návrh média – obsah hlavních prvků (C, H, N, O, S, P)
fyziologick funkce m dia
fyziologické funkce média
  • uhlík, vodík, kyslík, dusík, fosfor, síra, kationty a stopové prvky, voda...
  • část oxidována na CO2 (disimilace), využití takto získané energie na syntézu biomasy ze zbylé části (asimilace)
  • poměr asimilované a disimilované části je závislý na stupni redukce C-zdroje
  • maximální výtěžnost substrátu - čím více oxidovaný zdroj uhlíku, tím více je ho disimilováno a méně asimilováno odrazí se to v YX / S
hlavn element rn slo ky
hlavní elementární složky
  • VODÍK – hlavní zdroj je katabolický NAPDPH+
  • KYSLÍK – plynný, mění typy metabolismu
  • DUSÍK – amonné soli, dusičnany, aminokyseliny, močovina, pepton, hydrolyzát kaseinu, kvasničný extrakt
  • FOSFOR – anorganické fosfáty
  • IONTY KOVŮ – Fe, Mg, K, Ca...
    • definované roztoky nebo komplexní org. zdroje
dal nezbytn slo ky
další nezbytné složky
  • stopové prvky – Na, Mn, Co, Ni, Cu
  • růstové faktory - esenciální org. sloučeniny, které si buňka neumí sama syntetizovat
    • vitamíny – často kofaktory enzymů
    • L-aminokyseliny – především glutamová
    • puriny a pyrimidiny - syntéza nukleových kyselin
  • VODA – pitná, deionizovaná, destilovaná...
  • odpěňovadla – povrchové napětí, oleje, polyglykoly polymery (PPG)
ph a iontov rovnov ha
pH a iontová rovnováha
  • stabilizace pH – užití pufrů v médiích
    • organické kyseliny, fosfáty, peptony, TRIS, HEPES …
  • regulace pH
    • NaOH, NH3, H3PO4, H2SO4
  • iontová síla, redox – ovlivňují růst, produkci a produkty
p prava inokula
příprava inokula
  • uchování kmenů
    • lyofilizace, tekutý dusík, hluboké zmrazení
    • přeočkovávání na pevných půdách
  • revitalizace v kapalném médiu – třepání
  • inokulační tanky
    • poměr 1:10 až 1:20
    • důraz na růst, nikoli produkci, často komplexní média a převod do definovaných
    • co nejméně inokulačních stupňů
po adavky na aseptick proces
požadavky na aseptický proces
  • sterilita – nepřítomnost živých organismů
  • odstranění veškerých živých MO ze zařízení
  • zabránění vstupu kontaminace po sterilaci
  • zachování sterility – ekonomika procesu, bezpečnostní hledisko
  • sterilizace bioreaktoru a veškerého dalšího zařízení a portů (potrubí, ventily, filtry, příchozí i odcházející vzduch, vzorkovací zařízení, senzory atd.)
rovn po adavk na istotu
úrovně požadavků na čistotu
  • pro dekontaminace životního prostředí
  • pro agrotechnologie
  • pro krmivářství
  • potravinářská kvalita
  • pro biochemii, biotransformace
  • farmaceutická a medicínská kvalita
kontaminace m e zp sobit
kontaminace může způsobit
  • likvidaci producenta (bakteriofágy)
  • produkci toxinů (bezpečnost produktu, inhibice produkčního kmene)
  • produkci enzymů (degradace produktu)
  • snížení výtěžnosti (spotřeba substrátu)
  • produkci metabolitů (polysacharidy)
  • spotřebu části substrátu (výtěžnost)
sterilizace m dia a bioreaktoru
sterilizace média a bioreaktoru
  • ostrou párou min 121ºC, 0.2 MPa
  • horkým vzduchem 150-180ºC
  • chemicky – ethanol, chlornan sodný, fenol, formaldehyd....
  • UV, X-rays – většinou povrchy, prostory
  • ultrafiltrace – plyny, roztoky
  • velké bioreaktory in situ (SIP), malé v autoklávu
hodnocen sterility
hodnocení sterility
  • D-hodnota – snížení počtu zárodků na 1/10
  • závisí na odolnosti mikroorganismu
    • N – počet živých zárodků, t – čas sterilizace, k - konstanta MO pro mokré/suché teplo
  • Bacillus subtilisD121 = 0.4 - 0.7 min (mokré teplo)
  • pro N0/Nt = 1012 je t = 12.D
sterilizace parou in situ
sterilizace parou in situ
  • naplnění médiem, zapnutí přívodu páry, míchání pomalé, horní otvor otevřen, ostatní uzavřeny, zahřátí média, vypuzení vzduchu, dosažení 100ºC
  • uzavření horního otvoru, jediná cesta – kondenzátor, sterilace filtrů (in/out), sterilace potrubí a výpustního ventilu, dosažení 121ºC, sterilace 20 minut
  • ochlazení na kultivační teplotu
  • nutnost sterilního vzorkování a filtrace vzduchu
sterilizace vzduchu a odplyn
sterilizace vzduchu a odplynů
  • možnost sterilizace velkých objemových průtoků:
    • vzdušnění obvykle 1 VVM
    • 10 m3 reaktor – za 48 h 29 000 m3 vzduchu
    • koncentrace MO ve vzduchu – 1-10/L vzduchu
    • ultrafiltrace – splňuje všechny požadavky, používá se ke sterilizaci vzduchu, hydrofobní membránové filtry vpatroně, póry 0.1 μm
inokulace
inokulace
  • aseptické převedení inokula do bioreaktoru vyššího stupně
  • sterilizovatelné potrubní spojení
    • čerpání tlakem sterilního vzduchu
  • sterilní inokulační jehly
  • septa v aperturách ve víku bioreaktoru
  • čerpání peristaltickými čerpadly
    • inokulum nepřichází do styku s čerpadlem
slide33

přestup tepla, aerace

a přestup kyslíku

p estup tepla
přestup tepla
  • vznik tepla - míchání (příkon míchadla 15 kJ/m3.s, aerace, činnost mikroorganismů
  • aerobní procesy – množství uvolněného tepla proporcionální spotřebovanému kyslíku,
    • Q(kJ/m3.s) = 0,12 . OCR(mmol O2/m3.s)
    • Q – rychlost produkce tepla, OCR – rychlost spotřeby kyslíku 450 kJ tepla/mol utilizovaného O2
  • submerzní kultury 3-15 kJ/m3.s
  • odvod tepla – chlazení, externí plášť, interní vestavby
  • scale-up – přestup kyslíku a tepla limitující (omezená chladicí plocha – vyšší objem, menší chladicí plocha)
aerace provzdu ov n
aerace (provzdušňování)
  • aktivní přísun vzduchu do bioreaktoru za současné účinné dispergace – velké mezifázové rozhraní
  • stupeň dispergace
    • Db – průměr bublin (2-3 mm), ε – plynová zádrž
  • vvm – volume/volume/minute
    • VG – průtok vzduchu
    • Vr – objem reaktoru
p estup kysl ku
přestup kyslíku
  • rychlost přestupu kyslíku (oxygen transfer rate)
  • rychlost spotřeby kyslíku (oxygen uptake rate)
vlivy na p estup kysl ku
vlivy na přestup kyslíku
  • C*: rovnovážná koncentrace kyslíku
    • teplota, tlak a charakter kapaliny (koncentrace solí, viskozita)
  • C: aktuální koncentrace kyslíku
    • geometrie nádoby - průměr, kapacita, konfigurace a velikost míchadla, příkon, zarážky
    • aerace - velikost a umístění distributorů vzduchu, způsob operace
    • vlastnosti kapaliny (morfologie a koncentrace MO, odpěňovací činidla) ovlivňují C
  • velké fermentory (>5000 L) OTR < 300 mmol/L.h
jak zv it p estup kysl ku za dan ch podm nek
jak zvýšit přestup kyslíkuza daných podmínek
  • zvýšení průtoku vzduchu
  • zvýšení otáček míchadla
  • zvýšení tlaku v bioreaktoru
  • zvýšení obsahu kyslíku ve vzduchu
  • závislosti jsou nelineární
slide39

submerzní kultivace v

kapalném médiu

SLC

submerzn bioreaktory
submerzní bioreaktory
  • kyslík - aerobní, anaerobní
  • konstrukce
    • míchání - mechanické, pneumatické nebo hydraulické
    • fluidní vrstva
    • náplňové
    • membránové
    • fotobioreaktory
    • ...........
hlavn funkce bioreaktoru
hlavní funkce bioreaktoru
  • zajistit ideální prostředí pro růst a tvorbu produktu
    • médium → živiny → homogenita →míchání
    • médium → živiny → přítokování
    • aerobní procesy → přestup kyslíku → míchání, aerace
    • tepelná bilance → míchání, temperace
    • regulace pH
m ch n bioreaktoru
míchání bioreaktoru
  • s mechanickým mícháním
  • s pneumatickým promícháváním
    • probublávané reaktory
      • prosté
      • s vnitřními vestavbami (air-lift)
        • s cirkulační trubkou
        • s vnější cirkulací
  • fluidní lože
pneumaticky m chan reaktory
pneumaticky míchané reaktory
  • vstup energie pouze plynnou fází (aeračním plynem)
  • vzduch vstupuje zespoda tryskami
  • aerobní kultivace
  • vhodné pro MO citlivé ke střižným silám
  • výhody: jednoduché zařízení, neporuchové, investičně nenáročné, rychlost přenosu kyslíku vysoká
  • nevýhody: ne pro média s vyšší viskozitou, velká spotřeba vzduchu, pěnění média
probubl van reaktory
probublávané reaktory
  • cylindrická nádoba, poměr 1:2 (kolona)
  • rozdělovač plynu obvykle naspodu reaktoru
  • nepřítomnost speciálních difuzorů a vestaveb
  • přestup kyslíku a míchání – dáno rychlostí proudění vzduchu a reologií kapaliny
  • maximální rychlost míchání obvykle ≤ 0,1 ms-1
  • nevýhoda – obvykle malý přestup O2
air lift reaktory
air-lift reaktory
  • vestavby – zarážka, cirkulační trubka
  • funkce vestaveb:
    • dostatečná dispergace plynu – umožňuje obnovování mezifázového povrchu – zvyšuje přestup kyslíku
    • organizování toku fází
    • zvýšení doby prodlení plynu
    • zvýšení mikroturbulence
air lift reaktory cirkulace
air-lift reaktory - cirkulace
  • systémy s vnitřní cirkulací
    • difuzor pod cirkulační trubkou, vzestupné proudění v trubce, část odplynů odchod horní částí, v mezikruhové ploše proudí kapalina zpět dolů
    • cirkulační trubka
  • systémy s vnější cirkulací
    • 2 kolony spojené ve spodní a horní části
    • aerovaná kolona – větší průměr
    • úplná separace bublin z kapaliny v horní části reaktoru
    • indukovaná cirkulace směruje vzduch a kapalinu v reaktoru
reaktory s fluidn m lo em i
reaktory s fluidním ložem I
  • vhodné pro imobilizované MO nebo enzymy, flokulované MO
  • kapalina proudí vzhůru – suspendace pevné fáze
  • podobné probublávaným reaktorům, horní část rozšířená – redukce povrchové rychlosti – pevné
  • částice se vracejí do střední části, kapalina odchází
  • lze probublávat vzduchem/jiným plynem – zvýšení turbulence a míchání
  • příliš lehké částice – použití nosiče, zvýšení sedimentační schopnosti
  • náplňové bioreaktory
  • pevná matrice (porézní x neporézní, polymer x rigidní materiál), biokatalyzátor
reaktory s fluidn m lo em ii
reaktory s fluidním ložem II
  • přívod živin, kontinuální, proudí přes náplň, metabolity a produkty odváděny
  • výška náplně – hustota a kompresibilita nosiče, proudění kapalin (tlak na nosič), prostor pro proudění plynů
  • nehomogenní prostředí – změna koncentrace živin s výškou náplně, gradient pH, špatné promíchávání
  • využití – reakce, kde se vyskytuje inhibice produktem (rozdílná koncentrace produktu podél náplně)
dal typy bioreaktor
další typy bioreaktorů
  • fotobioreaktory
    • fotosyntetizující kultury – mikrořasy, cyanobakterie
  • bioreaktory pro kultivaci na pevné fázi
  • bioreaktory pro kultivaci živočišných buněk
mechanicky m chan reaktory
mechanicky míchané reaktory
  • třífázový systém: plyn-kapalina-pevná fáze
  • účel míchání – homogenizace, dispergace
  • koncentrační a teplotní homogenita
  • střihové napětí – rozbíjení bublin – velká mezifázová plocha
  • vysoká turbulence – přestup látky a tepla
  • mechanické míchadlo (disková turbína, 4-6 listů, d asi 0.3 dT)
  • vzdušnění zespoda
  • zarážky pro optimální promíchávání (4-8, d asi 0.1dT) – zamezení vzniku víru
  • aerační věnec - bubliny rozbíjeny míchadlem
  • vrchní část - odplyny
mechanicky m chan bioreaktor tlakov n doba i
mechanicky míchaný bioreaktor – tlaková nádoba I
  • 1 - nádoba bioreaktoru
  • 2 - plášť
  • 3,4 - izolace
  • 5 – přívod inokula
  • 6 – porty pro pH elektrody
  • 7 - míchadlo
  • 8 – aerační věnec
  • 9 – ucpávka
  • 10 - převodovka
  • 11 – motor
  • 12 – vypouštěcí otvor
mechanicky m chan bioreaktor tlakov n doba ii
mechanicky míchaný bioreaktor – tlaková nádoba II
  • 13 – chlazení pláště
  • 14 – vzorkovací otvor s připojením páry
  • 15 – prosklená plocha (pozorování obsahu)
  • 16 – přívod roztoků na úpravu pH a odpěňovadla
  • 17 – vstup vzduchu
  • 18 – víko
  • 19 – přívod média
  • 20 – odvod vzduchu
  • 21 – porty na různé senzory (O2, T,…)
  • 22 – rozbíječ pěny
  • 23 – přívod páry
  • 24 – tryska
dispergace m ch n m
dispergace mícháním
  • rozbíjení bublin – velká mezifázová plocha – vysoký přestup O2 do kapaliny
  • vytvoření dostatečného střihového napětí
  • nutno znát maximální střihové napětí, které mikroorganismy snáší
  • kompromis mezi maximální dodávkou kyslíku a homogenizací a velikostí střihových sil
z kladn typy m chadel
základní typy míchadel
  • vrtulové
    • vysoká čerpací kapacita, menší střižné síly, axiální tok
  • turbínové
    • otevřená disková turbína s dělicím kotoučem, vzduch přiváděn do aeračního věnce pod míchadlem; výhody – vysoké střižné síly způsobují dispergaci vzduchových bublin, dělicí kotouč zabraňuje zkratovému toku vzduchu kolem hřídele; nevýhoda – omezená čerpací kapacita
mechanick m chadla
mechanická míchadla
  • nahoře: disková míchadla - různý směr lopatek
  • dole:
    • a) vrtulové
    • b) diskové s narážkami
    • c) diskové bez narážek
z kladn konfigurace
základní konfigurace
  • obvykle více míchadel – zlepšení homogenizace (vzdálenost 1-1.5 D)
  • rychlost míchání – limitace dle systému (vibrace)
  • velikost míchadla – větší průměr – lepší míchání (D/DT = 0.4-0.5)
  • zarážky – zlepšení míchání, minimalizace vzniku víru, 4 ks 0.1 DT
  • vzdušnění – zlepšení míchání
p kon m chadel
příkon míchadel
  • pro newtonské kapaliny

příkonové číslo je funkcí Reynoldsova čísla

P0 – příkonové číslo, ρ – hustota, n – otáčky, d – průměr míchadla, μ – dynamická viskozita

slide60

důvodem pro intenzívní míchání není obvykle homogenizace, ale

přestup kyslíku

charakter kultiva n ch vak
charakter kultivačních vaků
  • stupňování požadavků na čistotu a sterilitu
  • citlivost tkáňových kultur na střižné síly
  • předsterilizované jednorázové plastové kultivační vaky
  • kultivační objemy od stovek mililitrů až po tisíc litrů
  • nedostatek kyslíku – jemná dispergace
  • náklady na jednorázové zařízení jsou vysoké - drahé produkty
bioreaktory s vlnov m m ch n m
bioreaktory s vlnovým mícháním

1: základna,

2: čep,

3: vsádka,

4: vak,

5: výstupní filtr, 6: vstupní filtr.

v bava kultiva n ch vak
výbava kultivačních vaků
  • apertury pro vstupy a výstupy médií, inokula, aeračního plynu a výdechového plynu
  • sterilita plynů se zajišťuje mikrofiltry
  • spoje jsou realizovány jednorázovými trubkami, hadicemi a konektory
  • jednorázové senzory pro kultivační parametry - pH, teplotu, koncentraci rozpuštěného kyslíku
vaky s mechanick m m ch n m
vaky s mechanickým mícháním
  • nedostatečné míchání v plastových vacích
  • plastové nebo ocelové mechanické míchadlo
  • pohyblivé spojení je zajištěno magnetickou spojkou, nebo různými typy plastových či keramických ucpávek
  • vak je často umístěn v ocelové nádobě
charakter a pou it mbr
charakter a použití MBR
  • charakteristická zádrž buněk nebo nosičů
  • je možné dělení produktů
  • katalyzovaná reakce (retězec reakcí)
    • mimo membránu
    • uvnitř membrány (funkcionalizovaná membrána)
  • vhodné pro
    • kultivace tkáňových buněk, kmenových buněk
    • čištění odpadních vod
funk n d len mbr
funkční dělení MBR
  • bioreaktory se separací buněk (biomass separation membrane bioreactor, BSMBR)
  • bioreaktory s aerací přes membránu (membrane aeration bioreactor, MABR)
  • extraktivní bioreaktory, kde se odděluje metabolit či produkt (extractive membrane bioreactor, EMBR)
  • bioreaktory s výměnou iontů na membráně (ion exchange membrane bioreactor, IEMBR)
perfuzn bioreaktory
perfuzní bioreaktory
  • distribuce media sítí kanálů k buňkám - kontinuální výměna média
hollow fibre bioreaktor
hollow-fibre bioreaktor
  • dvou-kompartmentový systém
    • intrakapilární a extrakapilární prostor
      • svazek dutých vláken
      • rovnoměrný průtok pro všechna vlákna svazku
    • svazek dutých vláken je uložen v cylindrickém pouzdře, kterým proudí extrakapilární tok
    • semipermeabilní membrána - selektivní prostup složek média
v hody ssc
výhody SSC
  • jednoduchost a nenáročnost na strojní vybavení
  • vyšší objemová koncentrace produktů
  • efektivnější izolace produktů
  • jednodušší inokulace, absence tvorby pěny
  • menším objem odpadů
  • některé organismy se v submerzním prostředí kultivují obtížně, nebo netvoří žádané produkty (např. některé vláknité mikroorganismy, nebo tkáňové buňky adherující na pevné povrchy)
  • uvádí se vyšší odolnost ke kontaminaci, protože SSC představují selektivnější prostředí z hlediska dostupnosti substrátu a snížené vlhkosti.
  • je obtížnější zajistit sterilitu technicky
nem chan bioreaktory
nemíchané bioreaktory
  • nemíchaný a neaerovaný
    • otevřená vana, nad kterou cirkuluje vzduch
  • nemíchaný a aerovaný
    • packed-bed – suchý substrát ve vertikálním loži, zespoda vháněný zvlhčovaný vzduch
m chan bioreaktory
míchané bioreaktory
  • s aerací nebo bez
    • bubnové rotační, bubnové s lopatkami
    • vertikální s oběžným míchadlem
z kladn typy kultivac
základní typy kultivací
  • vsádková (batch)
    • uzavřený systém, není průběžný přítok živin ani odvod metabolitů
  • přítokovaná (fed-batch)
    • přítok média ano, odvod média ne – objem reaktoru není konstantní
  • kontinuální (continuous cultivation)
    • otevřený systém, plynulý přítok a odtok média, konstantní objem reaktoru
vs dkov kultivace batch
vsádková kultivace (batch)
  • uzavřený systém
  • všechny živiny i inokulum přivedeny na počátku kultivace
  • živiny postupně spotřebovávány, akumulace biomasy a metabolitů – činností metabolismu MO
  • konstantní objem bioreaktoru
  • zanedbává se změna objemu – úprava pH, odpěňování, vzdušnění
f ze r stu v batch re imu
fáze růstu v batch režimu
  • lag fáze
  • exponenciální fáze
  • stacionární fáze
  • fáze odumírání
  • mezi jednotlivými fázemi tranzientní stavy
  • požadavky: minimalizace lag fáze, prodloužení a exponenciální fáze
exponenci ln f ze r stu
exponenciální fáze růstu
  • intenzivní a pravidelný růst – lze ho sledovat jako koncentraci buněk nebo biomasy
  • T – doba zdvojení, n – počet generací
maximalizace
maximalizace μ
  • složení média, teplota, pH, DOT, koncentrace substrátů atd.
  • množství vytvořené biomasy přímo úměrné množství spotřebované živiny
  • výtěžnost (yield):
  • rychlost růstu úměrná rychlosti spotřeby živiny a naopak
  • hodnota YX /S za různých podmínek různá
zen vs dkov ho procesu
řízení vsádkového procesu
  • produkce biomasy – maximální délka exponenciální fáze růstu
  • produkce primárního metabolitu – prodloužení exponenciální fáze růstu za současné produkce metabolitu
  • produkce sekundárního metabolitu – krátká exponenciální fáze, prodloužená stacionární fáze
p tokovan kultivace fed batch
přítokovaná kultivace (fed-batch)
  • jedna nebo více živin dávkováno do bioreaktoru během kultivace, produkt zůstává v bioreaktoru
  • přítok média ano, odvod média ne – Vr není konstantní
  • řízení rychlosti přítokování limitujícího substrátu řízení rychlosti spotřeby substrátu řízení reakčních rychlostí a metabolismu
  • výhoda – řízenou změnou koncentrace živin lze ovlivnit výtěžek nebo produktivitu
  • živiny jsou dodávány během kultivace, neodvádí se médium - objem bioreaktoru roste
uplatn n fed batch
uplatnění fed-batch
  • substrátová inhibice (methanol, ethanol, kyselina octová, atd.)
  • hustá kultura – vysoká koncentrace buněk
  • glukosový efekt (over-flow metabolismus)
  • katabolická represe – snadno metabolizovatelný zdroj (glukosa)
  • optimalizace tvorby metabolitu – produkce AK, řízené udržování nízké koncentrace S
  • prodloužení produkční fáze (oddělení produkční a růstové fáze) – sekundární metabolity
zen p tok i
řízení přítoků I
  • koncentrace substrátu se udržuje konstantní nebo se mění podle optimálního algoritmu
    • pomalý konstantní přítok média – lineární růst celkové biomasy
    • exponenciální přítok média – exponenciální růst biomasy
  • přítokování média podle zvoleného parametru spojeného s růstem biomasy nebo produkcí (zpětnovazebná regulace)
zen p tok ii
řízení přítoků II
  • podle předem daného schématu – přerušovaný nástřik podle vypočtené funkce
  • přímo – měření koncentrace substrátu v bioreaktoru, podle toho upraven nástřik
  • nepřímo – měření jiných parametrů, které jsou spjaté s metabolismem buňky – DOT, pH, CO2 a O2 v odplynech atd.
kontinu ln kultivace
kontinuální kultivace
  • otevřený systém
  • plynulé(nepřetržité) dodávání živin (média)
  • plynulý odběr média pozměněného metabolickou činností MO i s částí biomasy
  • rychlost přítoku = rychlost odvodu
  • konstantní objem bioreaktoru
  • rozmnožování za optimálních podmínek
typy kontinu l chemostat
typy kontinuálů - chemostat
  • chemostat
    • konstantní rychlost přítoku média F (konstantní zřeďovací rychlost D, rychlost přítoku substrátu = rychlost spotřeby substrátu) mikroorganismy si podle podmínek nastaví konstantní μ a konstantní X
dal typy kontinu l
další typy kontinuálů
  • turbidistat
    • konstantní turbidita (koncentrace biomasy) – mění se D (automatická regulace)
  • auxostat
    • konstantní parametr spjatý s růstem – mění se D (nutristat: S=konst, oxistat: DOT=konst, CO2stat: CO2=konst)
optimalizace bioprocesu
optimalizace bioprocesu
  • konstrukce/selekce produkčního kmene
  • optimalizace složení média
  • výběr typu kultivace
    • podle optimalizovaného parametru, technických možností a dalších kritérií
  • optimalizace kultivačních parametrů (pH, teplota, aerace, míchání...)
optimalizace slo en m dia
optimalizace složení média
  • kvalitativní a semikvantitativní složení
    • baňkové pokusy, využít optimalizační metodu, např. experimentální design odvozený od Response Surface Methodology, Optimal či Central Composition Design, ke snížení počtu experimentů
  • kvantitativní složení
    • vychází z experimentů v laboratorním fermentoru a vhodného strukturovaného modelu s bilancí procesu, mění se v čase
bilan n modelov n
bilanční modelování
  • matematický model procesu nebo zařízení
    • vztahy popisující jeho chování v čase
    • diferenciální rovnice, nelineární rovnice

VSTUP + ZDROJ = VÝSTUP + AKUMULACE

identifikace modelu konstanty
identifikace modelu - konstanty
  • aproximace empirických dat metodou nejmenších čtverců
  • optimalizace, extrém funkce, účelová funkce = kritérium optimalizace
  • optimalizační proměnné, např. μ, π, YP / X, YP / S
optimalizace kultiva n ch parametr
optimalizace kultivačních parametrů
  • teplota
    • optimální růstová teplota kmene, lze využít pro změny rychlosti růstu a produkce
  • pH
    • optimální růstové pH kmene, lze omezit kontaminaci, vliv složení média, indikátor metabolismu
  • aerace (řízení DOT)
    • podle metabolismu produkce, limitace kyslíkem v různých fázích, řízení dostupnosti energie, změny metabolismu
monitoring a automatizace
monitoring a automatizace
  • konstrukční součást bioreaktoru
  • senzory a zařízení pro měření základních stavových veličin
    • pH, teplota, DO, redox, DCO2, odplyny, X, S, P
  • měření a řízení základních procesních parametrů
    • otáčky míchadla, průtok vzduchu, tlak, přítoky
  • analogové měřící a řídící jednotky
  • DDC (Direct Digital Control) realizované PLC
  • nadřazené monitorovací, archivační a řídící systémy
z kladn regulace
základní regulace
  • pH – automatizované dávkování H+ a OH-
  • teplota – dvojitý plášť, pára, tepelná média
  • DO –
    • otáčky míchadla – asynchronní elektromotory, frekvenční měniče
    • průtok vzduchu - kompresory, turbodmychadla, škrtící regulace podle MS měření
    • tlak – tenzometrická čidla, regulace na výstupu podle SP
  • přítokování -
    • tlakové nebo peristaltické pumpy, měření nejpřesněji vážením reaktoru nebo zásobníku
ad