J.M. Zúñiga. SPEA.CIC.UGR Jornadas Armonización. Mayo, 2011

1. J.M. Zúñiga. SPEA.CIC.UGR Jornadas Armonización. Mayo, 2011

2. Posibles mecanismos correctores • Índices de severidad • Escalas de invasividad • Aplicación criterios de PF • Fichas de supervisión (IBAs) • Habituación y socialización. • Técnicas de EA Refinements are modifications in animal-based procedures that either decrease pain, distress, and discomfort or increase animal well-being. Morton (2000). ILAR Journal V41(2) 2000. Humane Endpoints for Animals Used in Biomedical Research and Testing. http://dels.nas.edu/ilar/jour_online.asp?id=jour_online

3. Clasificación de la severidad de los procedimientos. Directiva, 2011 Los Estados miembros velarán por que todos los procedimientos se clasifiquen: "sin recuperación" "leves" "moderados" "severos",

4. Severidad de un Procedimiento relacionada con: • Deprivación y rangos de variables medibles o cuantificables • Conjunto de variables que pueden causar dolor, ansiedad o sufrimiento Muy relacionada con la aplicación de paliativos

5. Índice de severidad • Severidad: baja/Intermedia o alta.Escalas: • Descriptiva simple • Numérica • Analógica visual • Melbourne • Colorado, etc. Para establecer dolor “agudo” • Margen discriminación observador valorar dolor. • Margen relacionado con capacidad para percibirlo Hombre hasta 20 niveles de dolor desde – a + Animal < gº sensibilidad. < 10 niveles fiables

6. Protocolos supervisión • Permiten detectar a los animales que experimentan dolor o sufrimiento intenso. Imprescindibles para aplicar medidas correctoras. • Investigador debe diseñar ficha de supervisión individualizada antes del procedimiento, especialmente cuando dicho procedimiento sea de severidad media o alta.

7. ¿ Es difícil evaluar el estado?, con un poco de observación ¡NO!: • Conocer conducta y apariencia normal • Observación de signos clinicos del estado del animal Signos claves (ILAR, LASA, FELASA) y criterios claves (Morton & Grifith, 1985)

8. Ficha de supervisión • Peso: menor consumo alimento y crecimiento. Parámetro >> útil en CRÓNICOS. Pérdidas => 20-25% • Aspecto: • Piloerección, pelo desordenado, sin brillo • Estrés crónico inhiben acicalamiento • Secreciones oculares o nasales • Restos de diarrea en la región perianal • Aparición halo porfirinas en ojo (cromodacriorrea). • Posturas anormales antiálgidas y temblores

9. Protocolos de supervisión: • Permiten detectar dolor o sufrimiento • Son imprescindibles.

10. RCEND POINT • Se define como el momento en el cual se reduce, minimiza o termina el dolor y/o diestrés* del animal, mediante acciones tales como: •  Eutanasia • Finalizar el procedimiento doloroso • Tratamiento paliativo dolor y/o diestrés. • El EP debe ser compatible con el experimento. • *Similar el concepto de sufrimiento

11. Objetivos para definir un EP: • Realizar las observaciones apropiadas (conducta, fisiología...) • Asignar valores a las observaciones realizadas • Determinar que observaciones son las más indicadoras de dolor y/o diestrés en la investigación • Determinar que observaciones pueden predecir mejor un mayor deterioro del animal para, identificar el punto mas temprano donde aparecen los síntomas. • Establecer EP significativo y objetivo

12. Observaciones apropiadas de los animales • Evaluación del dolor: •  cambios de peso corporal • apariencia física externa • signos clínicos medibles • cambios en la conducta espontánea • respuestas conductuales a estímulos externos Importante, conocer las características conductuales de la especie, animal o cepa (los roedores y lagomorfos pueden NO mostrar muchos cambios conductuales aun cuando sufren dolor).

13. Protocolo • Observar al animal sin molestarlo. Ver si manifiesta conductas normales o anormales y sus reacciones a estímulos externos • Examen clínico. Los signos clínicos y las mediciones se anotan • Usar tablas de cuantificación estandarizadas (facilitar recogidas datos). • + signos de dolor y/o diestrés relacionados con la condición bajo estudio (se deben usar).

14. Posibles áreas de deprivación psicológica o biológica-1 Denegación de: • Alimento / agua • Sueño / Auto limpieza • Privacidad / Espacio vital • Relaciones sociales / Contacto confortable • Estimulación sensorial • Desfogue de agresividad

15. Posibles áreas de deprivación psicológica o biológica-2 Denegación de: • Evitación / Actividad esqueleto muscular • Exploración/Elección • Cambios ejecutables del ambiente • Medioambiente natural o naturalizado • Oportunidad para desarrollar otras pautas de conducta • Analgésicos frente al dolor

16. Estudios de toxicología • Me toca bailar con la/el más… • Mayor esfuerzo en Alternativas…. EPAA (Asociación Europea de Enfoques Alternativos)

17. Public Funding for 3Rs Research Sobre 12 m € Carcinogenomics VITROCELLOMICS INVITROHEART ESNATS  NanoTEST • Reprotect • Sens-it-iv • ACuteTox • OSIRIS • PREDICT-IV

18. Modelos Animales en Procesos Biológicos Evaluación preclínica y seguridad de productos químicos, farmacéuticos, aditivos alimentarios, cosméticos u otros • Comportamiento fisiológico/patofisiológico después del tratamiento con una sustancia • Efecto farmacológico/tóxico de sustancias • Concentraciones eficaces de medicamentos • Efectividad y seguridad de vacunas • Reacción a materiales/sustancias ajenos (xenobioticos)

19. “La Gran carnicería” • Libro Blanco de sustancias químicas que impulsa la Comisión Europea de MA • La Comisaria de MA de la UE, Margot Wallström, propone la revisión de 30.000 de los 100.000 productos químicos que están actualmente en el mercado. • ¡OJO! Responsable la industria química

20. El informe comunitario cifra el coste económico para la industria en 32.000.106 € • La consultora Mercer Management Consulting estima que significaría una pérdida del 1.8% del PIB anual de la UE, cifras que la industria hace suyas.

21. Tipos de toxicidad • AGUDA (sin supervivencia): se pueden mantener un mínimo de horas o días • SUBAGUDA (supervivencia a corto plazo). • CRÓNICA (supervivencia a largo plazo). medidas de control máximo. • (i) Con observación constante • (ii) con observación ocasional

25. Li LifeLab

26. Tipos de ensayos • DL50 oral en rata (15 cada 14 días por ensayo - dos ensayos a la vez- n= 30) • Irritabilidad dérmica en conejo: 3 cada 14 días/ensayo –2 ensayos- n=6- • DL50 inhalatoria en ratas: 10 (5 ♀♀ y 5 ♂♂) por cada nivel de dosis y aprox. son de 3 a 5 niveles. 50 ratas cada 14 días • Absorción dérmica: 25 ratas cada 14 días por ensayo • LC50 en Pez cebra. Efecto en organismos acuáticos. 35 (7/concentración). • DL50 en aves (Coturnix coturnix).

27. Hepatotoxicidad provocada por plantas medicinales Kava kava (Pipper methysticum). Se le atribuyen propiedades ansiolíticas y contra el insomnio. En 2006, la FDA restringe su uso debido a efectos hepatotóxicos.

28. Suiza (2001) Holanda (2000-01) Nivel Dolor N % N % Bajo 343.385 69.8 419.576 56.6-52.0 Moderado 112.351 22.8 186.114 25.1-29.2 Severo 36.480 7.4 135.484 18.3-18.8 ¿ Se produce realmente dolor? Aprox 2.7 million (2005,UK). 21.5% test toxicidad Acute/subacute lethal studies (124.000 animals) Acute/subacute range-finding, limit testing, etc(109.000) Reproductive/teratogen/mutagen studies (71.400 )

29. 1. Leve:Niveles de severidad Directiva 2011 • Farmacocinético,única dosis y nº limitado de muestras de sangre (totalizando < 10% del volumen circulante). No se prevé que la sustancia cause ningún efecto nocivo perceptible; • Administraciónde sustancias por vía subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, por sonda gástrica e intravenosa a través de los vasos sanguíneos superficiales. Sustancia sólo tiene un efecto leve en el animal, y los volúmenes se encuentran dentro de límites apropiados para el tamaño del animal • Estudiosque implican la privación a corto plazo de interlocutores sociales, enjaulado solitario a corto plazo de ratas o ratones adultos de cepas gregarias;

30. 2. Moderado: • Estudios de determinación de la gama de dosis causante de toxicidad aguda, subaguda y/o pruebas de toxicidad crónica/ carcinogenicidad, con EP no letales

31. 3. Severo: • Toxicidad, con situaciones fisiopatológicas intensas y EP muerte. Ej, toxicidad aguda con una única dosis (ver OCDE) • Ensayo de potencia de una vacuna, caracterizada por la (i) alteración persistente del estado del animal, (ii) enfermedad progresiva que causa la muerte, (iii) asociada con dolor, angustia o sufrimiento moderados duraderos.

32. GUIDANCE DOCUMENT ON THE RECOGNITION, ASSESSMENT, AND USE OF CLINICAL SIGNS AS HUMANE ENDPOINTS FOR EXPERIMENTAL ANIMALS USED IN OECD, 2000. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment SAFETY EVALUATION

33. CLINICAL SIGNS AND CONDITIONS OF ANIMALS REQUIRING ACTION BY ANIMAL CARE STAFF AND STUDY DIRECTORS.

34. MC Toxicidad aguda •  Interacción de compuesto con las células y los tejidos corporales y no sus efectos terciarios (físicos) • Estudio piloto previo a la investigación para determinar los comportamientos indicadores de dolor. • Este estudio se hace < nº animales y dosis bajas para poder fijar los end points. • También se tendrá en cuenta la morbilidad en lugar de la mortalidad

35. MCToxicidad subcrónica ( 6 m) y crónica (24 m) •  Estudio sea efectivo la supervivencia > del 50%. • Alojamiento para envejecidos (> 18 meses): • Exceso de peso: lesiones en cojinete plantar, obesidad y tumores • Jaulas piso sólido y un lecho adecuado. • Agua y el alimento suministro especial.

36. MCEnfermedades infecciosas, vacunas... En animales infectados por bacterias Tª < de 34ºC implica la muerte . El endpoint se fija cuando: • Existe perdida de peso superior al 20% • La disminución de Tª animal es > 4ºC. Los signos evidentes de dolor y sufrimiento son: • Pelo erizado // Perdida de peso • Descarga ocular // Letargia • Encorvamiento // Ataxia • Hipotermia

37. Estudios de nutrición

38. Tipos de estudios • Relacionados con toxicidad de aditivos alimentarios • Actuación y diseño de alimentos funcionales • Alteraciones y disfunciones (anorexia, obesidad) • Patologías del sistema digestivo

39. 1. Leve: • Alimentación con dietas modificadas, que no cubren las necesidades nutricionales de todos los animales y se prevé que causen una anomalía clínica leve en el periodo de estudio; •  Confinamiento a corto plazo (< 24h) en j-metabólicas; • Adicióna la dieta de marcadores inertes para seguir el paso de la ingesta • Retirada de alimentación durante un periodo < a 24h en ratas adultas;

40. . Moderado: • Uso de jaulas metabólicas que impliquen una restricción moderada de movimientos durante un período prolongado (hasta 5 días); • Estudios con dietas modificadas que no cubren las necesidades nutricionales de todos los animales y que se espera que causen una anomalía clínica moderada en el periodo de estudio; • Retiradade la alimentación durante 48 horas en ratas adultas;

41. 3. Severo: • Uso de jaulas metabólicas que impliquen restricción severa de los movimientos durante un período prolongado; • Inmovilizaciónde ratas para inducir úlceras gástricas o fallo cardiaco por estrés; • Inflamaciones o ulceraciones irreversibles en colon y digestivo

42. En Modelos inducidos o manipulados.Ejemplo aplicados estudios de nutrición 1. Administración substancias biológicasactivas:diabetes con aloxano o de estreptotozina. 2. Pormanipulación quirúrgica:ligadura pilórica; hepatectomía parcial (regeneración hepática), etc 3. Por inducción basada en dietas modificadas: carenciales o suplementadas base para el estudio de hiperlipemias, esclerosis vasculares, hipovitaminosis, cancerogénesis.

43. Modelos dolorosos (colitis o inflamación intestinal) • Mediante un enema de 10 mg de ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS) en 0,25 ml de etanol al 50% • Suplementación del agua de bebida con sulfato de dextrano sódico (DSS) al 5% (p/v) en el agua de bebida. • Por transferencia de poblaciones linfocitarias por vía intraperitoneal a ratones SCID.

44. Modelos inducidos 4. Inducción por cambios etológicos:modificaciones de factores sociales o entorno, aslamiento, inmovilización. 5. Manipulación genética: transgénicos, obtención de > nº modelos especiales y comprensión de acción de tipo patológicos & terapéuticos

45. Ejemplos concretos • R obesa Zucker (fa/fa). Obesa a 5 sem.; edad, pesando a las 40 sem. doble Rnormal. Por hipertrofia-hiperplasia > tamaño, nº adipocitos. • r Non Obese Diabetes. Insulino dependiente. infiltración del parenquima pancreático por linf. CD8 y CD4, B y macrofagos.

46. Restricción de movimientos

47. Alimentación Controlada • En períodos de tiempo fijados (uno o más /día) los animales consumen tanta comida como quieran • Para estudios con estado nutricional controlado. • Sistemas automáticos de acceso al alimento (chronofeeder) • Permiten controlar la cantidad de comida 

48. Reducción inmovilización

49. Envejecimiento/ Life span

50. Los vicios adquiridos-transmitidos reciclaje y actualización • Reticencia aplicación de analgesia Ej. Con colitis ulcerosa, la acción de probioticos no varia con ketofen y buprenorphina • Métodos invasivos anticuados Ej. Vías de administración y extracción en desuso • Inmovilización innecesaria Ej retenedores vs telemetría y teledetección • Aislamiento prolongado sin justificar Ej. Animales aislado en alimentación restringida • Métodos de eutanasia inapropiados Ej. Inhalación éter vs sobreanestésico, CO2 vs C02+ O2