电泳基本理论
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电泳基本理论 内容摘要 1 概述 2 电泳的基本原理 3 电泳系统 4 支持介质 5 染料 6 影响因素. 1 电泳概述 1.1 电泳的定义 带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极方向移动,这种现象称之为电泳 (electrophoresis ,简称 EP) 。 电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。

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电泳基本理论

内容摘要

1 概述

2 电泳的基本原理

3 电泳系统

4 支持介质

5 染料

6 影响因素


1电泳概述

1.1电泳的定义

带电颗粒在电场的作用下,向着与其电性相反的电极方向移动,这种现象称之为电泳(electrophoresis,简称EP)。

电泳技术就是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的一类实验技术。

带电颗粒在电场中移动是物质的一种运动现象。移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质及数目等因素有关。


1.2电泳技术的发展过程

电泳现象早在1808年就已经被发现,但电泳作为一种分离技术却是在1937年由瑞典科学家Tiselius A首先提出来的,并设计出世界上第一台自由电泳仪,建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动,首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的,为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献,1948年他被授予诺贝尔奖。


20世纪50年代,以支持介质为主的电泳模式不断涌现,如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。

60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法,如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。

1967年Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。

70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式,如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。


90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。多年来科学家们对电泳结果的分析做了大量的工作,建立了各种实验方法,电泳后对分离物质可以用染色、扫描、紫外吸收、放射自显影、生物活性测定等方法进行分析,得到所需数据。


1.3电泳的常用术语

(1)电泳迁移(electrophoretic migration):

在电泳过程中,带电粒子在电场的作用下做定向移动,单位是cm。

(2)迁移时间(migration time):用tm表示

在电泳过程中,带电粒子在电场的作用下做定向移动所用的时间,单位是min。

(3)电泳速度(electrophoretic velocity):用Vep表示

在单位时间内,带电粒子在电场的作用下做定向运动的距离,单位是cm /sec。


(4)电场强度(electric field strength):用E表示

在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电效应,单位是 V/cm。

E = V /Lt

式中V为电压,Lt为两端电极的距离。


A

B

(5)电渗流(electroosmotic flow):用EOF表示

在电场中电泳溶液的正电荷与固体支持物表面上的负电荷之间相互作用,形成一个正离子层,导致流体朝负极方向移动,称为电渗流,这种现象也称之为电渗(electroosmosis)现象,如图。


电渗流迁移速度(Vep)的表达式为:

εξ

电渗流迁移速度Vep = —————  E

4πη

式中为电解常数,为支持物与表面平切面的Zeta电势,为缓冲液粘度,E为电场强度。

通常情况下,电渗流总是由正极向负极移动,只有在特殊情况下如分离碱性蛋白质的阴极电泳时溶液pH较低,固体支持物表面带正电荷,形成向正极移动的电渗流。电渗流的大小受到Zeta电势,偶电层厚度和缓冲液粘度等因素的影响,直观地看电渗流随着电解质浓度的增加而增加,随着pH值的增加而加大。


(6)相对迁移率(relative mobility):用mR表示蛋白质样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁移率,即

蛋白质的迁移距离(cm)

mR = —————————————

示踪染料的迁移距离(cm)


2电泳的基本原理

2.1带电颗粒

溶液中任何物质由于其本身的解离或表面吸附其它带电质点而带电,在电场中就会发生迁移,移动方向取决于它们的带电符号。

NaCl → Na+ + Cl –

生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中,它们的净电荷取决于溶液终的H+浓度


2.2电泳迁移率(mobility)

如果把生物大分子的胶体溶液放在没有干扰的电场中,使带电颗粒具有恒定迁移率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E,即:

F = QE (1)

带电颗粒在迁移中同时受到来自于介质的摩擦力F’,对于球形颗粒来说,在自由溶液中此阻力服从Stock定律:

F’ = 6π r η v (2)

这里v是在介质粘度为η的溶液中,半径为r的带电颗粒的移动速度。但在凝胶中,这种阻力并不完全符合Stocks定律。F’还取决于介质中的其它因素如凝胶厚度、颗粒大小和介质的内渗等。


当带电颗粒达到稳态运动时,F=F’,由(1)、(2)式推导出:

v Q

——— = ———— (3)

E 6πr η

不同的带电颗粒在同一电场中运动速度不同,其泳动速度用迁移率(或称泳动度)m来表示,定义为在电位梯度E(V/cm)的影响下,颗粒在时间t(s)中迁移距离d(cm),即在单位电场强度(1 V/cm)时的泳动速度:

v d

m = —— = ——— (4)

E t·E


(3)代入(4),得到

Q

m = ———— (5)

6πr

由上式可看出电泳迁移率与球形分子、介质粘度、颗粒所带电荷有关。在确定的条件下,某物质的迁移率为常数,是该物质的物化特性常数。从(4)式可以导出迁移率的单位是cm2·s-1·V-1。


2.3带电颗粒的移动速度v与电位梯度E、电流密度J和导电性K的关系

如果在同样实验条件下对某蛋白溶液做两个电泳试验,一个试验用两倍的时间一倍的电压,另一个试验用一倍的时间两倍的电压,从理论上讲,这两个试验中蛋白质的迁移距离应该是相等的。但是实际上只能是大致相等,原因是在电泳过程中还有其他因素的干扰,如在增加电压的同时也增加了热效应。移动的速度决定于其分子的形状、相对分子质量的大小、分子带电性质及数目,还与分离介质的阻力、溶液粘度及电场强度等因素有关。


我们把带电颗粒的移动速度用以下公式表示

v = m·E= m·J/K (6)

由此可以看出,带电颗粒的移动速度v等于电位梯度E和迁移率m的乘积,与电流密度J和迁移率m的乘积成正比,与溶液的导电性K成反比。也就是说,电场强度越高电泳速度越快;溶液的导电性越强,电泳速度越慢。因此电泳速度随着电位梯度或溶液的导电性的变化而改变。


3电泳的分类

3.1按分离原理分类

(1)区带电泳(zone electrophoresis,ZEP):是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液,然后在介质上加电场,带电颗粒在支持介质上或支持介质内迁移,在电泳过程中,不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带(图3-2a),这是当前应用最广泛的电泳技术。


(2)移界电泳(moving boundary electrophoresis,MBEP):是把电场加在生物大分子溶液和缓冲溶液之间的界面上,带电颗粒的移动速度通过光学方法观察界面的移动来测定(图3-2b)。

(3)稳态电泳(steady state electrophoresis):带电颗粒在电场作用下电迁移一定时间后达到一个稳定状态,此后,电泳条带的宽度不随时间的变化而变化,如等速电泳(isotachophoresis,ITP)、等电聚焦电泳(isoelectric focusing,IEF)(图2c、2d)。


a b c d

图3-2 各种电泳分离原理示意图

a 区带电泳 b 移界电泳 c 等速电泳 d 等电聚焦


4 d电泳系统

4.1电泳仪及附属设备

从第一台商品自由移界电泳系统的问世以后,近50年来电泳仪器的发展迅猛,尤其是随着凝胶电泳技术的成熟及广泛应用,各种类型的凝胶电泳装置层出不穷,使电泳技术得以迅速发展。凝胶电泳仪作为实验室的常规小型仪器,种类很多。随着科学技术的不断发展,电泳仪器的分析对象也越来越专门化,分辨率越来越高,操作越来越简单,性能越来越稳定。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。


4.2 d电泳仪:

根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类:

(1)常压电泳仪(600V):用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;

(2)高压电泳仪(3000V):用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序;

(3)超高压电泳仪(30000-50000V):用于毛细管电泳。


4.2 d电泳槽:

根据电泳种类不同,对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。

(1)自由界面电泳槽

Tiselius设计的自由界面电泳槽(图3-3)是一个U形玻璃管,在U形管下部放待分离的蛋白溶液,管臂联接到电极上,在电场的作用下,缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相,得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。


电极 d

电极

U形管

3 Tiselius自由界面电泳装置示意图


(2) d管状电泳槽

50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖,上电泳槽具有若干个孔,可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻璃管内,凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条,样品经电泳分离,蛋白区带染色后呈圆盘状,因而称圆盘电泳(disc electrophoresis)。



(3) d板状电泳槽

板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽,是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间,因而称板状电泳(slab electrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳,便于利用各种鉴定方法,直接比较各样品的区带,保证结果的准确可靠;还可进行双向电泳。另外,板胶电泳时产生的热量容易消散,凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。


垂板电泳槽 转移电泳槽

平板电泳槽 双向电泳槽


制备电泳槽 转移电泳槽


4.3 转移电泳槽附属设备

随着电泳技术的发展,电泳技术的种类逐渐增加,凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善,科学家们研制出各种电泳附属设备,如梯度混合仪、外循环恒温系统、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。


5 转移电泳槽电泳的操作模式

目前最常用的电泳操作模式是区带电泳中的聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳,前者主要用于蛋白质的分离鉴定,后者主要于核酸的分析鉴定。电泳的操作模式有按操作方式和分离原理分类。


5.1 转移电泳槽按电泳方式分类

(1)端电极电泳:有垂直式和水平式两种方式,多用于蛋白质电泳。

(2)搭桥电泳:为水平式,水平板状电泳槽形式多样,凝胶和缓冲液通过间接接触的方式,如用滤纸桥搭接,用缓冲液制作的凝胶条或滤纸条搭接(图3-4),后两者即半干技术,多用于免疫电泳、等电聚焦。


A B C

图4 水平板状电泳中凝胶与缓冲液的接触方式

A 滤纸桥 B 凝胶条 C 滤纸条

(3)潜水电泳:

为水平式,电泳时凝胶浸于缓冲液中,多用于核酸电泳。


5.2 C按分离原理分类

(1)净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳;

(2)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳;

(3)聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳;

(4)聚丙烯酰胺凝胶双向电泳;

(5)聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦;

(6)聚丙烯酰胺凝胶转移印迹电泳;

(7)琼脂糖凝胶水平电泳;

(8)琼脂糖凝胶脉冲电泳;

(9)琼脂糖凝胶免疫电泳。


6 C凝胶电泳的支持介质

6.1支持介质的性质

采用支持介质进行电泳的目的是防止在电泳过程中分子的对流和扩散,使被分离物质得到更有效的分离。支持介质应当具备以下特性:

(1)物理化学性质稳定:在电泳过程中不受环境因素的影响,保持原有的状态和性能。

(2)化学惰性:在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子和待分离的生物大分子发生化学反应,不干扰生物大分子的电泳过程。

(3)分布均匀:内电渗小,结果重复性好


6.2 C支持介质的分类

电泳的固体支持介质可以分为两类:

(1)薄膜类:

薄膜类包括纸类,醋酸纤维素薄膜,聚酰胺薄膜等.

这类支持介质化学惰性好,在电泳过程中产生的对流和扩散较小,分离的基本原理主要是基于生物大分子的电荷密度。


(2) C凝胶类:凝胶类包括淀粉凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶等。

这类介质相对薄膜类又了进一步,它具有高粘度和高摩擦阻力,它在电泳过程中不仅能防止对流,减小扩散,还具有凝胶的多孔性,孔径与蛋白质分子大小大致相同,因而能产生分子筛效应(molecular sieving effect),其分离作用既与电荷密度有关,又与分子大小有关,因而凝胶的分离原理是基于大分子的电荷密度和分子大小,对分离不同相对分子质量的生物大分子极为有利。所以,生物大分子如蛋白质和核酸电泳多采用凝胶类介质。淀粉凝胶由于质量难以控制,操作繁琐,分辨率低,实验室中已很少使用,现在用得最多的是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶。


7 C凝胶支持介质

7.1聚丙烯酰胺凝胶

7.1.1聚丙烯酰胺凝胶的特性

聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体(monomer)丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacrylamide,简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophorsis,简称PAGE)。聚丙烯酰胺凝胶用于电泳的支持介质,与其它凝胶相比,聚丙烯酰胺凝胶具有以下优点:


(1) C孔径大小与生物大分子具有相似的数量级,具有良好的分子筛效应。根据待分离大分子的相对分子质量,通过改变凝胶浓度及交联剂度来调节凝胶的孔径,使大分子得到较好的分离。

(2)在一定浓度范围内,凝胶透明,有弹性,机械性能好

(3)凝胶是由—C—C—C—C—结合的酰胺类多聚物,侧链上具有不活泼的酰胺基,没有其它带电基团,所以凝胶性能稳定,电渗作用小,无吸附,化学惰性强。与生物大分子不发生化学反应,电泳过程中不受温度、pH的变化的影响。


(4) C具有高分辨率和灵敏度,尤其是在不连续电泳系统中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体,样品不易扩散。并有多种染色方法提高电泳条带显色的灵敏度,分离蛋白质的灵敏度可达10-6g。

(5)单体纯度高,在相同的实验条件下,电泳结果具有很好的重复性。


(6) C凝胶杂质少,在很多溶剂中不溶,可适用于少量样品的制备,不致污染样品。

以聚丙烯酰胺凝胶为支持物发展起来的电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳、等电聚焦及双向电泳等电泳技术,不仅能分离、小量制备生物大分子,而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。


7.1.2 C聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式

聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化,使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化(AP—TEMED)和光化学催化(核黄素——TMTED)体系。

(1)AP-TMTED催化体系:属于化学聚合作用,TMTED是一种脂肪族叔胺,分子式为

H3C\ /CH3

N(CH2)2N

H3C/ \CH3


它的碱基可催化溶液中的 CAP使其形成游离氧自由基,激活Acr单体形成单体长链,同时在交联剂Bis的作用下长链彼此交联聚合成凝胶,反应式如下:

·TEMED催化AP生成硫酸自由基:

S2O82- → 2SO4·¯

·硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链:


Bis C将单体长链间连成网状结构:


聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、pH、温度、分子氧和杂质都会影响凝胶的聚合过程。

(2)核黄素-TEMED催化系统:属于光聚合作用,聚合原理是核黄素在光照条件下分解,被还原成无色核黄素,后者在有少量氧的条件下,被氧化形成自由基,从而引发聚合反应。


7.1.3 聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、凝胶总浓度及交联度与凝胶的性质:

(1)凝胶总浓度与凝胶特性:

凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性,包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要参数。1962年Hjertén S引入两个计算公式,即凝胶总浓度(T)是表示凝胶溶液中单体和交联剂的总百分含量

a+b

T = ———×100%

m

交联度(C)是表示凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的百分含量。


b聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、

C = ———×100%

a+b

式中,a为丙烯酰胺单体的质量(g),b为交联剂N,N’-甲叉双丙烯酰胺的质量(g),m为溶液的终体积(ml)。

凝胶a、b的比例是很重要的,决定了凝胶的物理性状。

当a:b小于10时,凝胶脆且硬,不透明,呈乳白色;

当a:b大于100时,即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状;

通常用a:b在30左右,并且丙烯酰胺浓度高于3%,凝胶富有弹性并且透明。


(1)聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、凝胶总浓度及交联度对孔径的关系:

聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于凝胶的总浓度T和交联度C。

有效孔径随着T的增加而减小,电泳中带电颗粒移动时受到网孔的阻力大,反之带电颗粒受到的阻力小。

当凝胶总浓度小于2.5%时,可以筛分相对分子质量为106以上的大分子,但此时凝胶几乎是液体,通常要加0.5%的琼脂糖来增加凝胶的硬度而不影响凝胶的孔径大小;

当凝胶浓度大于30%时,则可以筛分相对分子质量小于2kD的多肽,

在凝胶总浓度一定时,交联剂含量不同影响凝胶的孔径,交联剂的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系见表3-1:


总凝胶浓度聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、

(%)

平均孔径(Å)

Bis占总凝胶的百分数

1

5

15

25

6.5

24

19

28

8.0

23

16

24

36

10.0

19

14

20

30

12.0

17

9

15.0

14

7

表3-1 Bis的含量与不同凝胶浓度平均孔径之间的关系


从表中可以看出,聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、当Bis占总凝胶浓度5%时,凝胶的平均孔径在各凝胶浓度时均最小,高于或低于5%时孔径相应变大。

凝胶孔径大小也受凝胶总浓度的影响,一般凝胶总浓度越高,凝胶孔径越小。凝胶孔径大小有一定范围,每次制备凝胶时所得到的有效孔径不完全相同。


(3)聚合反应受各种因素的影响,如系统中催化剂和加速剂的浓度、凝胶总浓度与凝胶的分子筛效应:

凝胶的三维网状结构具有分子筛效应,在凝胶中生物大分子的分离取决于它的净电荷和分子大小。分子筛效应的大小取决于凝胶孔径大小与生物大分子大小相接近的程度。凝胶浓度不同,平均孔径也不同,不同大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力也不同,加上大分子的电荷效应,使各种大分子迁移率不同得以分离。


在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表3-2列出了蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系。大多数蛋白质在7.5%凝胶中能得到满意的结果,所以这个浓度的凝胶称为标准胶。当分析一个未知样品时,常用标准胶或梯度凝胶来测试,而后确定适宜的凝胶浓度。


蛋白质相对分子质量范围在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表(kD)

适用的凝胶浓度(T%)

<10

20—30

10—40

15—20

40—100

10—15

100—500

5—10

>500

2—5

表3-2 蛋白质相对分子质量与凝胶浓度的关系


7.2 在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表琼脂糖凝胶

7.2.1琼脂糖凝胶的特性

琼脂糖(agarose)是从琼脂中精制出来的胶状多糖(gel-forming polysaccharide),琼脂又是从天然的红色的墨角藻(red-seaweed)中提取出来的。琼脂含有两种多糖,即琼脂糖和琼脂胶,从琼脂胶中脱去硫酸酯基和丙酮酸酯基就可获得琼脂糖。琼脂糖的分子结构大部分是由1,3连接的-D吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水-D吡喃半乳糖交替而成。


(1) 在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表琼脂糖凝胶属于大孔胶,可以分析107的大分子,但电泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种大孔特性有利于免疫固定、免疫电泳和微量制备。琼脂糖形成凝胶后孔径的大小取决于琼脂糖百分浓度,如表3-3;

表3-3琼脂糖凝胶的浓度与孔径的关系

琼脂糖(%)

孔径(nm)

0.075

800

0.16

500

1.0

150

2.0

20


(2)在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表具有稳定的物理化学性质,对样品吸附极小,电泳图谱清晰,分辨率高,重复性好;

(3)具有较高的机械强度,允许在1%或更低的浓度下使用,且在这种浓度下仍然有筛分和抗对流作用;

(4)琼脂糖无毒,具有热可逆性,胶凝过程不需催化剂,制备简单、快速。低胶凝温度及低熔点的琼脂糖有利于样品回收,达到样品制备的目的;

(5)琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,染色、脱色程序简单快速;


7.2.2在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表琼脂糖凝胶的主要性能指标:

(1)电内渗(electroendosmosis,简称EEO):是琼脂糖电泳中由多糖骨架上的带电基团引起,主要是硫酸酯和丙酮酸盐,这些阴离子基团被固定在介质中,相应的阳离子与其结合水一起向阴极移动(图3-6),电内渗对DNA的分离没有显著影响,但高电内渗时对大分子的迁移有一定阻碍作用,电泳耗时较长。


(1)在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表胶凝温度:将琼脂糖在溶液中加热至90℃溶解,然后将温度下降至某一温度时由液态转变为固态,此温度即为凝固点,称为胶凝温度。一般在35℃—43℃。

(3)熔化温度:将凝固的凝胶由固态转变为液态时的温度即熔化点,称为熔化温度。一般在75—90℃。用于制备目的时,采用低熔点琼脂糖,熔化温度需低于30℃,


(4)在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表凝胶强度:定义为每平方厘米凝胶所能承受的重量(g /cm2),凝胶强度与凝胶浓度成正比。凝胶强度越高,所能允许使用的凝胶浓度越小。在电泳中通常使用1%的琼脂糖凝胶。尿素和碘化钾等阻碍氢键形成的试剂也会降低凝胶强度,使凝胶变软易碎,给操作带来困难。

(5)脱水收缩作用:是指琼脂糖凝胶中挤压出液体的现象,使用时要用滤纸吸干凝胶表面的水。


7.2.3 在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表琼脂糖凝胶电泳在核酸研究中的应用:

由于琼脂糖凝胶孔径相当大,对大多数蛋白质来说,其分子筛效应微不足道。以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳已广泛应用于核酸研究中,为DNA分子及其片段的相对分子质量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。琼脂糖对DNA的分离范围较广,用不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。从表3-4中可以看到凝胶的浓度越低,适用于分离越大的DNA。


琼脂糖凝胶浓度在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表(%)

线性DNA分子的有效分离范围(kb)

0.3

5—60

0.6

1—20

0.7

0.8—10

0.9

0.5—7

1.2

0.4—6

1.5

0.2—4

2.0

0.1—3

表3-4 不同琼脂糖凝胶浓度与分离DNA大小范围的关系


7.3在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表新型凝胶介质

虽然聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是目前最常用的两种支持介质,但是它们还存在一定的局限性,如聚丙烯酰胺凝胶聚焦的重复性较差,琼脂糖凝胶容易断裂等。近年来人们正在寻求新型的电泳材料。

第一类:丙烯酰胺单体替代物如poly-N-acryloyl-tris(NAT)、N-acryloyl sugars、N-acryloylaminoethoxye thanol(AAEE)等。这类N-取代聚丙烯酰胺材料具有以下优点:


具有较强的水解稳定性,在较广的在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表pH范围内稳定,能在pH2—13环境中进行电泳,适合作为酸碱性pH范围等电聚焦的支持介质;

具有高度的亲水性和大孔性,适合大相对分子质量物质的分离;凝胶的机械强度高。


第二类:聚丙烯酰胺在实际工作中,常依据待分离蛋白质已知相对分子质量的大小来选择所合适的凝胶浓度,使蛋白质混合物得到最大限度的分离,表—琼脂糖混合物(Polyacrylamide-agarose mixture)、聚丙烯酰胺—琼脂糖的衍生物混合物(polyacrylamide-allylglycidyl mixture),这类电泳支持介质具有以下优点:

具有聚丙烯酰胺分辨率高和琼脂糖大孔径的优点,机械强度高,又具有良好的弹性,适合分离特大分子(2500kD),可用于病毒、SDS变性分子和高相对分子质量的脂蛋白


第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:

机械强度大,结构稳定,可以是亲水的也可是疏水的;

可以直接测量孔径,孔径范围在nm—100μm;


8 第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:蛋白染染料

用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。选择高吸光系数的染料,与生物大分子紧密结合,形成有色不溶的复合物,而支持介质不吸附染料,便于背景的脱色,有利于蛋白质条带的辨别和定量扫描,从而检测出蛋白质的纯度、含量及生物活性。

可用于蛋白质电泳条带的染色方法很多,常用的主要有以下几种:


8.1第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:氨基黑类染色:

蛋白质染色最早是用氨基黑类染料,是一类含有磺酸基的酸性染料,它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合盐。常用的有:

氨基黑10B(amino black 10B)

萘黑12B 200(naphthalene black 12B 200)

萘酚篮黑6B(naphthol 6B)

水牛黑(buffalo black)等。


这类染料对不同的蛋白质着色不同,有第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:

蓝色

棕色

黑色,

借此可以鉴别不同类型的蛋白质。这类染料对不同的蛋白质结合量不同,染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低,现在这类染料已很少应用,被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。


8.2第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue,简称CBB)

在蛋白质染色中,目前考马斯亮蓝染色法最为常用,1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色,它步骤简便、灵敏度较高,可进行定量扫描。它可分为R和G型两类:

R型为三苯基甲烷(triphenylmethane),每个分子含有两个SO3H基团,本身偏酸性,磺酸基与蛋白质的碱性基团结合形成染料—蛋白质复合物。

G型为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue),是一种甲基取代的三苯基甲烷。考马


SO第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:3Na

R-250 G-250


考马斯亮蓝第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合,尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内(15—20 g),扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。

考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250,其优点是在三氯乙酸中以胶体形式存在,能选择性地和蛋白质形成复合物,染色迅速,着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来,约45分钟后着色最深,本底低,重复性好,适用于定量分析。


8.3第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:荧光染料:

是一种在电泳前用荧光分子将蛋白质共价偶联标记,于电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法,但由于荧光标记蛋白质的定量需要特殊的扫描装置,影响了此方法的广泛应用。研究工作中使用的荧光染料有以下几种:

(1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰,dansyl chloride,简称DNS-Cl):是最早应用的荧光染料,它在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应,使它们获得荧光性质,在280nm和320nm波长的紫外灯下可观察到电泳条带。


(2)第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:荧光胺(fluorescamine,又称fluram):作用与丹磺酰氯相似。在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应,产生荧光。其优点是由于自身及分解产物均不显示荧光,标记的蛋白质是唯一的荧光物质,因此,凝胶没有荧光背景。

(3)2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮[2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone,简称MDPF]:其作用与丹磺酰氯和荧光胺相似,其优点是凝胶上MDPF标记蛋白质的荧光可保持数月。用MDPF标记时,荧光强度在蛋白质浓度1—500ng范围内呈线性关系,标记蛋白做SDS-PAGE分析时,其相对分子质量的对数(log10)与相对迁移率之间呈线性关系。


(4)1第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonic acid,简称ANS):染料本身无色,但与蛋白质结合后,在紫外光下可显出黄绿色荧光。电泳后将凝胶置于此染料溶液中,1—3分钟后在长波紫外光下即可观察到荧光蛋白条带。


8.4第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:硝酸银染色:

目前染色机理尚不清楚,可能是将结合在蛋白质上的银离子还原成金属银而显色,研究表明蛋白质上碱性和含硫氨基酸在银染中的重要性,染色灵敏度是考马斯亮蓝R-250的100倍左右,可以检测0.38ng /mm2的牛血清白蛋白。银染显色的方法大致可以分化学显色和光显色两类。


(1)第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:化学显色法(chemical development):

又分为双胺银染法(diamine silver stains)和非双胺银染法(non-diamine silver stains)。

双胺法:是用碱性的NH4OH形成银—双胺复合物,固定后的凝胶浸泡在此溶液中,通过酸化(通常用柠檬酸)显像,使用较广泛。

非双胺法:是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中,银离子与蛋白质发生作用,在碱性条件下,用甲醛将银离子还原为金属银而显像,用酸性溶液(柠檬酸或醋酸)终止显色反应,用碳酸钠处理凝胶可进一步增强银染色的强度。非双胺法的灵敏度较双胺法高10倍。


(2)第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:光显色(photo development):

显色反应是固定后的凝胶在酸性环境中用光能将银离子还原成金属银而使蛋白条带显色,它的优点是操作程序简单,使用一种染色溶液即可达到显色目的。


8.5第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:特殊蛋白质染色:

(1)糖蛋白染色:糖蛋白可以通过对蛋白或碳水化合物的染色来检测。如与糖链的反应,用过碘酸-Schiff试剂(periodic-Schiff’s reagent)染色,简称PAS染色,显色结果在543nm处可观测到颜色。检测灵敏度,最高可以达到40 ng糖蛋白。

(2)脂蛋白染色:脂蛋白可以用常规的染色方法,苏丹黑B(sudan black)是常用的染料,银染法仍然是最灵敏的方法。近年有报道一种双染色方法,先用一种发荧光的染料Filipin使脂蛋白染色,再用考马斯亮蓝使其它蛋白染色,这样就可以在一块凝胶上同时检测出脂蛋白和其它蛋白,灵敏度高,可检测低至20 ng低密度脂蛋白。


(3) 第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:铁蛋白染色:血红蛋白、转铁蛋白和其它含铁蛋白能用多种方法检测,如普鲁士蓝(prussian blue)显色,它与蛋白质分子中的铁离子结合,方法十分简便。

(4) 铜蛋白染色:可用茜素蓝S(alizalin S)显色,它与蛋白质分子中的铜离子结合,蛋白条带为蓝色。

8.6 酶活性染色

蛋白质经过电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳后可以保持生物活性,包括酶活性,这就给同工酶的检测创造了条件。


8.7第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:免疫学染色

免疫学方法是一种简单而且专一性的检测方法。将辣根过氧化物酶或放射性同位素标记的抗体用于免疫检测,经过酶与底物的显色反应,使与抗体免疫结合的蛋白条带清晰地显现出来。现在最常用的方法是凝胶电泳后通过电泳印迹将蛋白转移到固定化膜上,然后利用相应的抗体进行免疫检测。


9第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:影响电泳的环境因素

在电场中被分离物质的泳动速度除受本身性质如所带电荷的性质和数量、分子本身的大小和形状、分子的水化程度、解离趋势、两性行为等影响外,还与其它外界环境因素有关。

9.1 电场强度的影响:电场强度是指电场中每厘米的电位降,也称电位梯度或电势梯度。电场强度对电泳的速度起着重要作用,电场强度高,带电颗粒泳动速度快,电场强度低,带电颗粒泳动速度慢。


9.2第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:溶液pH值的影响:大部分生物大分子都具有阳离子和阴离子基团,这些基团的解离常数不同,溶液的pH值决定被分离物质带电基团的解离程度,所以生物大分子的净电荷取决于环境的pH值。pH影响着生物大分子的电泳迁移率,溶液的pH值距离蛋白质的等电点pI越远,蛋白质带电性越强,泳动速度越快;pH值距离蛋白质的pI越近,蛋白质带电性越弱,泳动速度越慢。电泳时为保持pH恒定,必须采用缓冲液作为电极缓冲液。在分离蛋白质时,要选择合适pH的缓冲液,使待分离的各种蛋白质所带的电荷数量有较大差异,有利于彼此分开。


9.3 第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:溶液离子强度的影响:溶液中的离子强度直接影响被分离物质的电动电势()。带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。如果溶液的离子强度越大,电动电势越小,泳动速度越慢;如果溶液的离子强度越小,电动电势越大,泳动速度越快。高离子强度时电泳条带较细窄。一般最适合的离子强度在0.02—0.2之间。溶液离子强度的计算公式如下:

I = 1 /2∑scz2

式中,I为离子强度,s表示溶液中有s种离子,c为离子的摩尔浓度(mol /L),z为离子价数。溶液中离子种类多,浓度大,离子价数高,则离子强度大。


(1 第三类:“电泳海绵”,是一些海绵状的支持介质材料,还处于试验阶段,但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点:9.4 电渗的影响:固体支持物表面的电荷使支持物附近溶液分子形成偶电层,溶液在电场中向一定方向移动,即电渗现象,溶液移动的同时携带颗粒一起移动。

9.5 温度的影响:在凝胶电泳过程中要产生焦尔热,而热对电泳的分离效果影响很大。温度升高时,介质粘度下降,分子运动加剧,使自由扩散的速度变快,迁移率增加。

9.6 介质的影响:介质的交联度直接影响分离效果,介质的纯度影响聚胶效果,介质的非特异性吸附会增大电渗。