Princípios de Clonagem Molecular

1. Princípios de Clonagem Molecular Prof. Dr. Halbert Villalba

2. Clonagem • Princípio - Isolamento de DNA e obtenção de múltiplas cópias; • A recombinação entre moléculas de DNA de diferentes organismos é um fenômeno comum na natureza. Vírus como o fago l têm a capacidade de inserir o seu genoma no cromossoma de E. coli. Neste processo, eles podem mudar o conteúdo genético da célula e por vezes uma bactéria torna-se patogénica, ao receber nova informação genética de um vírus.

3. Clonagem • Houve descobertas em biologia molecular, que permitiram aos cientistas reproduzir no laboratório este fenômeno natural e desenvolver métodos para introduzir quase todo o tipo de informação genética num organismo. A maior parte destes avanços envolve a manipulação genética de bactérias como E. coli e B. subtilis, e a levedura S. cerevisae

6. Linguagem • Linguagem: • Biblioteca: coleção de clones recombinantes de uma fonte que sabidamente contém o gene, cDNA, ou outras sequências de DNA representadas na célula, tecido ou cromossomo original.

7. Clonagem - Linguagem • cDNA (DNA complementar): • Um DNA sintético copiado do RNA mensageiro (mRNA) pela enzima transcriptase reversa. Usado para referir-se a uma cópia de filamento único ou seu derivado de filamento duplo. • Clone: • Molécula de DNA recombinante que contém um gene ou outra sequência de DNA desejada.

8. Clonagem - Linguagem • Enzimas de Restrição: • Enzimas que reconhecem sequências de DNA de duplo filamento específicas e dividem o DNA no ou próximo ao sítio de reconhecimento. • Hibridização: • O ato de duas moléculas de ácido nucléico de filamento único complementares formarem ligações e se tornarem uma molécula de filamento duplo.

9. DNA Recombinante

10. Clonagem - Linguagem • Hospedeiro: • O organismo usado para isolar e propagar uma molécula de DNA recombinante. Em geral, uma cepa da bactéria Escherichia coli ou da levedura Saccharomyces cerevisiae. • Inserção: • Fragmento de DNA humano clonado num determinado vetor.

11. Clonagem - Linguagem • Ligação: • O ato de formar ligações de fosfodiéster para unir duas moléculas de DNA de duplo filamento por intermédio da enzima DNA-ligase. A Ligação é a etapa essencial na criação de moléculas de DNA recombinante. • Sonda: • Uma molécula de DNA ou RNA clonada, marcada com radioatividade ou outro marcador detectável, usada para identificar suas sequências complementares por hibridização molecular.

12. Clonagem - Linguagem • Southern blot: • Filtro para o qual DNA é transferido, geralmente após digestão por enzima de restrição e eletroforese em gel para separar as moléculas de DNA por tamanho (denominado em homenagem ao criador da técnica, Ed. Southern); também, o ato de produzir este filtro e hibridizá-lo com uma sonda. • Vetor: • Molécula de DNA na qual é clonado o gene ou outro fragmento de DNA desejado, capaz de se replicar num determinado hospedeiro. Os exemplos incluem plasmídios, o bacteriófago lambda, cosmídios e cromossomos artificiais de leveduras.

13. Princípios de Clonagem • 1 – Isolamento da sequência de DNA desejada; • 2 – Obtenção de múltiplas cópias da mesma num organismo, em geral uma bactéria, que seja capaz de crescimento durante longos períodos; • 3 – Grandes quantidades da molécula de DNA podem então ser isoladas na forma pura para análise molecular.

15. Princípios de Clonagem • Plasmídeos: • São moléculas de DNA de duplo filamento circulares que se replicam extracromossomicamente em bactérias ou leveduras. • Ideais para a produção de grandes quantidades de uma seqüência de moléculas curtas de DNA clonada.

16. Princípios de Clonagem • Plasmídeos: • As bactérias, em particular a Escherichia coli, constituem um dos principais materiais biológicos empregados na Tecnologia do DNA Recombinante. Isto se deve a vários fatores:- ciclo de vida rápido em relação aos organismos superiores.- cultivo de um grande número de indivíduos em um espaço pequeno- apresenta menor número de genes em relação aos organismos superiores- divisão celular por fissão binária.

17. Princípios de Clonagem • Plasmídeos: • Além do DNA cromossômico, a célula bacteriana contém pequenas moléculas de DNA circular denominadas PLASMÍDEOS. • Estes mantém uma existência independente do cromossomo; no entanto, sua duplicação é sincronizada com a da bactéria, garantindo assim sua transmissão para as bactérias-filhas. • Em Engenharia Genética, genes "estranhos" a bactéria podem ser incorporados aos seus plasmídeos, e assim, tais bactérias passam a produzir as proteínas que esses genes codificam. • Certos plasmídeos possuem genes responsáveis pela síntese de enzimas que destroem um antibiótico antes mesmo que ele faça mal a bactéria.

18. Princípios de Clonagem • Plasmídeos: • Os plasmídeos portadores de genes que conferem resistência a drogas são chamados PLASMÍDEOS R (R Resistência). • Eles possuem também, genes que permitem sua passagem de uma bactéria para outra (RTF ou Fator de Transferência de Resistência). • Quando dois ou mais tipos de plasmídeos R estão presentes em uma mesma bactéria, os genes de um deles pode passar para o outro. Esse mecanismo faz com que surjam plasmídeos R muito complexos, portadores de diversos genes para resistência a diferentes antibióticos. • Essa propriedade de genes para resistência a antibióticos passarem de uma molécula de DNA para outra fez com que os cientistas os classificasse de transposons ou genes saltadores.

21. Princípios de Clonagem • Bacteriófago Lambda: • Os vírus, principalmente o bacteriófago conhecido como fago lambda, são de grande utilidade na Tecnologia do DNA Recombinante. • Vírus bacteriano com uma molécula de DNA de duplo filamento relativamente grande. • Durante o crescimento em E. coli, o lambda replica-se produzindo números enormes de vírus infecciosos, depois destruindo as células bacterianas infectadas e liberando cerca de 1 milhão de bacteriófagos. • Durante esta fase infecciosa do crescimento, cerca de um terço do genoma do bacteriófago não é essencial, podendo substituir-se por outras seqüências de DNA, assim, é altamente adequado para clonagem de fragmentos relativamente grandes (até 20Kd) de DNA humano.

22. Princípios de Clonagem • Bacteriófago Lambda: • A região mediana do cromossomo, onde se localizam os genes dispensáveis, pode ser retirada e substituída por um pedaço de DNA de outro organismo. Sendo assim, quando o cromossomo viral se multiplica, o DNA estranho incorporado à ele também será multiplicado.Os cientistas têm utilizado essa técnica para conseguir a multiplicação de genes importantes a fim de obter grande número de cópias o que é necessário ao estudo de genes.

24. Princípios de Clonagem • Cosmídios: • Fragmentos ainda maiores de DNA estranho podem ser clonados em cosmídios vetores. • São plasmídios que usam a capacidade das partículas infecciosas de bacteriófagos lambda para acondicionar eficazmente grandes fragmentos lineares de DNA e introduzi-los em células bacterianas. • Após infecção de bactérias de maneira semelhante a de um vírus lambda, o cosmídio reassume a forma circular e replica-se como um grande plasmídio.

25. Princípios de Clonagem • Cromossomos artificiais: • Até meados da década de 1980 - o maior veículo de clonagem era o cosmídio; • Olson e cols – Cromossomos artificiais, técnica de clonagem de fragmentos muito maiores de DNA em vetores que se replicam e segregam no hospedeiro Saccharomyces cerevisiae (levedura de padaria).

26. Princípios de Clonagem • OBJETIVO: • Isolar um determinado gene ou outra seqüência de DNA em grandes quantidades para estudo adicionais; • 1ª. Etapa - Biblioteca – conjunto de clones de DNA recombinante de uma fonte que contenha o gene ou seqüência desejada. • 2ª. Etapa – Identificar o clone ou clones interessantes usando métodos de triagem sensíveis que sejam capazes de encontrar a cópia do clone desejada.

28. Clonagem molecular • Uma vez preparados os plasmídeos, a tarefa é inseri-los em células bacterianas. • Plasmídeos e células bacterianas são postos um em contato com o outro. • No entanto, apenas algumas bactérias conseguem absorver o plasmídeo novo, sendo necessário agora, selecionar na população de bactérias aquelas que realmente incorporaram o plasmídeo com o gene novo. • Alguns plasmídeos de bactérias carregam naturalmente genes que lhes conferem resistência a certo antibiótico. Os pesquisadores escolhem para DNA recombinante, plasmídeos que já têm o gene para resistência ao antibiótico. Em seguida, esses plasmídeos são abertos, e os genes a serem enxertados são encaixados.

29. Clonagem molecular • Esses plasmídeos são colocados em contato com bactérias sensíveis ao antibiótico, sendo que algumas destas os incorporam. • Para selecionar as bactérias que ganharam o plasmídeo novo basta adicionar o antibiótico ao meio de cultivo. • Todas as bactérias sem o plasmídeo morrem, por não serem resistentes ao antibiótico, restando somente as que possuem o plasmídeo com o gene para resistência ao antibiótico. • Essas bactérias se reproduzem e todo o clone resultante possuirá o plasmídeo com o gene novo.

31. Expressão de genes clonados em bactérias • Tão logo foram desenvolvidas as técnicas básicas de clonagem molecular, os biólogos concluíram que um gene de interesse, se estivesse ligado a um plasmídeo e fosse introduzido em uma bactéria, poderia eventualmente funcionar. • As bactérias portadoras desse gene se transformariam em verdadeiras fábricas, produzindo quantidades ilimitadas de proteínas que o gene codifica.

32. Expressão de genes clonados em bactérias • A primeira vez que se obteve síntese de uma proteína humana por uma bactéria transformada foi em 1977. • Um segmento de DNA de 60 pares de bases, contendo o código para a síntese da somatotrofina (hormônio de crescimento). Foi ligado a um plasmídeo e introduzido em uma bactéria, a partir da qual foram obtidos clones capazes de produzir somatotrofina. • Outros genes que codificam proteínas de interesse médico têm sido transplantados para bactérias, onde passam a funcionar. Já é possível introduzir genes humanos que codificam insulina e hormônio de crescimento em bactérias, as quais passam a fabricar essas substâncias.

33. Uso do DNA Recombinante na Terapia Gênica, e na produção de medicamentos • Terapia gênicaPela primeira vez, um método de terapia gênica reverteu os efeitos de uma doença genética chamada imunodeficiência combinada grave ligada ao cromossomo X (SCID). Pacientes que sofrem dessa doença, chamada SCID, são obrigados a viver em ambientes completamente isolados (como no filme "o rapaz da bolha de plástico"), pois o sistema imunológico não defende o corpo de infecções. No caso dos bebês da pesquisa, a doença impedia a produção de glóbulos brancos pela medula óssea. • Metodologia· Pesquisadores retiraram do vírus os genes que o tornam capazes de causar doenças. Em seu lugar foi inserido o gene remédio, isto é, que produzia corretamente a proteína defeituosa e que corrigia o problema nas células.· O vírus modificado foi misturado com células-tronco da medula óssea retiradas dos bebês. O vírus infecta as células e passa os genes terapêuticos.· Com o gene terapêutico, as células-tronco passam a produzir a proteína responsável pela estimulação das células de defesa, fazendo com que estas se desenvolvam, cresçam e se espalhem pelo corpo, destruindo os invasores.

34. Uso do DNA Recombinante na Terapia Gênica, e na produção de medicamentos • Biotecnologia animal e produção de medicamentosQuando se pensa nos animais como fábricas de proteínas interessantes para o Homem, o exemplo da insulina é o mais conhecido. No entanto, cientistas canadenses conseguiram transformar vesículas seminais de ratinhos em "biorreatores" (fábricas biológicas de substâncias de interesse).Para testar a viabilidade da técnica foi escolhida a proteína hGH (Hormônio de crescimento humano). • Metodologia· Para montar o "gene artificial", além da seqüência de bases contendo as instruções para produzir o hGH, foi utilizado também um promotor (seqüência especial de DNA que indica que tipo de tecido ou órgão o gene deve agir).· O DNA construído (transgene) foi microinjetado em vários embriões de camundongos. Obteve-se então, animais transgênicos produzindo hGH no seu sêmen.· O próximo passo é conseguir produzir o hormônio de crescimento (hGH) no fluído seminal do porco, dado que esse animal ejacula o maior volume de líquido seminal entre todos os animais domésticos.

36. Essa figura representa a introdução do DNA de uma pessoa com uma lesão (ex. neurológica) num óvulo “in vitro” com o objetivo de gerar um embrião.

37. No óvulo fecundado tem início a formação do embrião “in vitro”.

38. Após cinco dias de incubação “in vitro” do óvulo fecundado o número de células se multiplica formando o blastocisto. Essas células contêm células pluripotenciais para formação dos diversos tecidos do organismo e são conhecidas por células tronco.

39. As células pluripotenciais são extraídas do blastocisto e colocadas em outro meio de cultura enriquecido com proteínas específicas para induzir a produção de determinada célula tronco (no exemplo células tronco neurológicas). Por esse meio de clonagem terapêutica e com uso de meio de cultura com proteínas específicas será possível no futuro induzir células tronco com especificidade para os tecidos do coração, pâncreas, fígado, ossos, sangue, rim, etc..