Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 34

KROMATOGRAFİK YÖNTELER (SINIFLANDIRILMASI) BİLECİK ŞEYH EDEBALİ ÜNİVERSİTESİ 2013-2014 PowerPoint PPT Presentation


  • 146 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

KROMATOGRAFİK YÖNTELER (SINIFLANDIRILMASI) BİLECİK ŞEYH EDEBALİ ÜNİVERSİTESİ 2013-2014. KROMATOGRAFİ. Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin,biri sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması,

Download Presentation

KROMATOGRAFİK YÖNTELER (SINIFLANDIRILMASI) BİLECİK ŞEYH EDEBALİ ÜNİVERSİTESİ 2013-2014

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

KROMATOGRAFİK YÖNTELER (SINIFLANDIRILMASI)

BİLECİK ŞEYH EDEBALİ ÜNİVERSİTESİ

2013-2014


Kromatograf

KROMATOGRAFİ

Kromatografi, bir karışımda bulunan maddelerin,biri

sabit diğeri hareketli faz olmak üzere birbirleriyle

karışmayan iki fazlı bir sistemde ayrılması,

tanınması ve saflaştırılması yöntemlerinin genel adıdır.

Çeşitli maddelerin hareketli faz yardımıyla,sabit faz

üzerinde, değişik hızlarla hareket etmeleri veya

sürüklenmeleri esasına dayanır


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Kromatografi tekniğinin temelinde üç ana unsur yer alır.

• Sabit faz: Bu faz daima bir "katı" veya bir "katı destek üzerine emdirilmiş bir sıvı tabakasından" oluşur.

• Hareketli faz: Bu faz daima bir "sıvı" veya "gazdan" oluşur.

• Sabit faz, hareketli faz ve karışımında yer alan maddeler arasındaki etkileşimin türü: Kromatografide "yüzey tutunması veya adsorpsiyon" ile "çözünürlük" gibi olgular temel etkileşim türlerini oluştururlar.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

İlk kez Rus botanikçi Mikhail Tsvett (1903)

tarafından geliştirilen bir yöntemdir.

Tsvett bu yöntemi bitki pigmentlerinin(klorofil A,klorofilB ve ksantofil)

renkli bileşenlerini ayırmakta kullanılmıştır.

Kullandığı kolonda renkli bandlar

oluştuğundan, bu ayırma yöntemine

kromatografi adını vermişti


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Bir parça kağıt şeridin aşağı hizasından

1 cm kadar yukarısına bir damla siyah

mürekkep damlatınız

Kağıt şeridi, mürekkep damlattığınız

kısım su hizasının üstünde kalacak

şekilde su tankına batırınız ve dik bir

şekilde tutunuz. Su,kapiler etkisiyle

kağıt üzerinde yukarı doğru yürürken

mürekkebi çözer ve sürüklemeye

başlar. Mürekkebin içindeki bileşenler

kağıt üzerinde farklı hızlarda ilerleyerek

ayrılmış olur.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

1-Uygulama Biçimine Göre

2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre

3-Faz Tiplerine Göre

Kromatografi ‘nin Sınıflandırılması


1 uygulama bi imine g re

1-Uygulama Biçimine Göre

- Düzlemsel kromatografi

Kağıt kromatografisi

İnce tabaka kromatografisi (TLC)

-Kolon kromatografisi

Gaz kromatografisi (GC)

Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)

Süperkritik akışkan kromatografisi


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

• Adsorpsiyon kromatografisi

• Dağılma kromatografisi

• İyon değiştirme kromatografisi

• Jel filtrasyon (Moleküler eleme) kromatografisi

• İyon çifti kromatografisi

• Afinite kromatografisi

2-Ayrılma Mekanizmalarına Göre


3 faz tiplerine g re

3-Faz Tiplerine Göre

-Sıvı kromatografisi

Sıvı-Katı kromatografisi

Sıvı-Sıvı kromatografisi

-Gaz kromatografisi

Gaz-Katı kromatografisi

Gaz-Sıvı kromatografisi


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

KOLON KROMATOGRAFİSİ


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

depo

(tampon)

mobil faz

(tampon)

Protein

karışımı

sabit faz

(katı porlu matriks)

elüent

•Kolonkromatografisi:biyomoleküllerin

saflaştırılmasında sıklıkla kullanılır

•Kolon, biyomolekülleri seçici adsorblayan bir maddeyle (katı porlu matriks) doldurulur SABİT FAZ

•biyomolekül karışımı kolona tatbik edilir HAREKETLİ FAZ

•Tampon çözelti (MOBİL FAZ) ile

yıkanan kolon tarafından,

adsorbe edilmeyenler  önce

adsorbe edilenler  daha geç

kolonu terkeder.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Başlıca katı dolgu maddeleri (hareketsiz faz) şunlardır:

• Silika jel: Genellikle nötür ve asidik yapıdaki bileşikler için uygundur.

• Alumina: Genellikle nötür ve bazik yapıdaki bileşikler için uygundur.

• Sellüloz: Genellikle biyokimyasal maddeler için uygundur.

Hareketli faz görevini üstlenecek çözücüler; Sikloheksan, Kloroform (kansorojen), Metanol, Petrol eter, Metilen klorür, Etanol, Benzen(kansorojen), Etil asetat, Aseton, Toluen, Dietil eter, Karbon tetraklorür(kansorojen), n-Butanolİzopropanol olabilir.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

1903 yılında Tsvet bitki pigmentleriyle çalışırken

kolon dolgu maddesi olarak kireç kullanmıştı.

Günümüzde ise çoğunlukla silika jel ve alumina

kullanılmaktadır.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Kolon Kromatografi Tipleri

Kolondaki dolgu maddesi ve seçilen elüsyon

metoduna göre gruplandırılır:

i.Jel filtrasyonu  büyüklükii.İyon değişim  yük

iii.Affinite  (bağlanma)


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

i.Jel Filtrasyon Kromatografi

Karışımdaki moleküllerin molekül büyüklüklerinde göre ayrılması esasına dayanır

•Kolon, jel boncuklar(belli büyüklüğe sahip ve karışımdaki bileşenlerle etkileşmeyen bir madde)

ile doldurulur katı matriks

•Biyomolekül karışımını içeren tampon, kolondan geçirilir

Küçük moleküller,jel boncuklar arasındaki

boşluklara girer,kolondan geç çıkarlar.

Büyük moleküller,jel boncuklar arasındaki

boşluklara giremez ve kolondan hızlı bir

biçimde sürüklenerek önce çıkarlar.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Kromatografik ayırma sırasında bozunması veya degişikliğe

uğraması istenmeyen protein ya da enzim gibi biyolojik

moleküllerin birbirinden ayrılması için kullanılır.

Bu yöntem ile polimerlerin molekül ağırlığı dağılımı da tayin

edilebilir

  • Avantaj Büyük miktarda : biyomolekül karışımı saflaştırılabilir

  • Dezavantaj: Yavaş ayırım


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

ii.İyon exchange (değiş-tokuş)

Kromatografi

Maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştiricideki iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi esasına dayanır

İyon değiştirme kromatografisi, kullanılan iyon değiştiricinin anyon veya katyon aktarmasına göre sırasıyla anyon değiştirmekromatografisi veya katyon değiştirme kromatografisi olarak

adlandırılır.

Anyon değiştirme kromatografisinde,kolon içindeki sabit tabaka olan matrixe kovalent bağlı iyonlar pozitif yüklüdür,bu iyonlar kolondan geçirilen çözeltideki anyonları kendine çeker,çözeltideki anyonlar ayrılır,sadece katyonlar ortamdan çıkar.

Katyon değiştirme kromatografisinde ise,benzer sistemle çözeltideki katyonlar ayrılır,anyonlar ortamdan çıkar.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Cl- ve I- karışımının nitrat bağlanmış anyon

değiştirici RNO3ile bileşenlerine ayrılmasında

geçerli dengeler aşağıdaki biçimdedir:

Cl- + RNO3 RCl + NO3

I- + RNO3 RI + NO3

I

Anyon

Değiştirici

Cl-

R: Çözünmeyen Matriks

RNO3 : Anyon Değiştirici


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

İyon değiştirmeyi etkileyen faktörler

Hareketli faz derişimi

Hareketli faz pH’sı

Kompleks oluşturucu etki

İyon değiştirme kromatografisinin uygulanması

Ayrılmaları güç olan bazı iyonları ve asitlerin

Aminoasitler

Seyreltik iyon çözeltileri deriştirmede

Asit ve baz elde edilmesinde

NaCl↔NaOH + Cl


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

iii.Affinite Kromatografisi

Enzim, hormon,vb spesifik proteinlerin saflaştırılmasında kullanılır.Kolonun dolgu maddesine,(dekstran, poliakrilamid, selüloz vb)spesifik protein ile kompleks yapabilen bir ligand bağlanır:

Ligand ile kompleks yapan spesifik protein,katı desteğe bağlanarak kolonda tutulurken; serbest proteinler kolonu terkederler.

Bağlı protein, daha sonra, pH değişikliği / tuz çözeltileri veya ligand ilavesiyle kolondan elüe edilir

Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.

Seçiciliği fazla olan bu yöntem,kromatografi tekniklerinin en yenisidir.

Antijen – Antikor Enzim – Substrat Reseptör– İlaç

gibi oldukça spesifik etkileşimlere dayanır.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Kolon Kromatografisi

a)Gaz Kromatografi

(GC)

b)Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi

(HPLC)


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

a)Gaz kromatografisi

GC

Bir karışımda gaz halinde bulunan veya kolayca buharlaştırılabilen bileşenlerin birbirinden ayrılması amacıyla gaz kromatografisi yöntemi kullanılır. Bu yöntemde ayrılma, bileşenlerin farklı katı yüzeylerdeki farklı adsorpsiyon ilgilerine göre gerçekleşir. Numunede bulunan bileşenler bir cihazla spektrum haline getirilir ve bu spektrumda bulunan her pik ayrı bir bileşeni gösterir.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Hareketli faz olarak helyum, azot veya argon gibi inert bir gaz kullanılır ve bu gaza taşıyıcı gaz adı verilir. Kolon içinde kullanılan sabit faz; silika, alumina veya karbon gibi bir katı ise yöntem, gaz-katı kromatografisi adını alır. Eğer sabit faz kiezelguhr gibi inert katı bir dolgu maddesi üzerine tutturulmus uçucu olmayan bir sıvı film ise yöntem gaz-sıvı kromatografisi adını alır. Bu şekilde kullanılan kolonlara dolgulu kolonlar denilir.

Gaz kromatografisi yönteminde kolonlar 2-10 mm iç çapında ve 1-5 m boyundadır. Fakat inert bir katı dolgu maddesi üzerine uçucu olmayan bir sıvı kaplanması yerine, bu sıvı filminin doğrudan ince bir cam veya silika kapiler borunun iç yüzeyine tutundurulmasi ile 0.2-0.5 mm iç çapinda ve 10-50 m gibi çok uzun kapiler kolonların kullanılması mümkün olabilir. Bu nedenle kapiler kolonların verimliligi ve ayırıcılığı, dolgulu kolonlara oranla çok daha iyidir.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Gaz kromatografisinde, ilk olarak örneğin buharlaştırılması için ısıtılan bir bölme vardır. Hemen ardından sıcaklığı programlanabilen bir fırın içine yerleştirilmiş olan kolon gelmektedir. Sıvı örnekler bir şırıngayla bir septumdan giriş kısmına enjekte edilirler. Kolon çıkışına yerleştirilen bir dedektörden sinyal izlenir ve bir integratör ile kaydedilir. Gaz kromatografisi yönteminde incelenebilen maddeler için belli sıcaklıktaki alıkonma sürelerinin birbirinden farklı olmasından yararlanarak nitel analiz yapılabilir.Bir maddenin alıkonulma süresi, belli bir kolon için, belli sıcaklıkta ve belli taşıyıcı gaz akış hızında sabit bir değerdir. Bu sebeple de,bir iç standart maddesinin analiz örneğine eklenmesi ve sonuçların bu maddeye bağlı olarak belirtilmesi daha çok tercih edilen bir yoldur.

Gaz kromatografisi yönteminde nicel analiz ise kromatogramdaki piklerin altlarında kalan alanların hesaplanması ile veya pik yüksekliğinin ölçülmesi ile yapılır.Örneğin, enjekte ettigimiz bir karışımda baslangıçta eşit miktarlarda A ve B bilesenlerinin olduğunu varsaydığımız bir durumda, kromatogramda bu bilesenlere ait piklerin altında kalan alanlar da birbirine eşit olacaktır.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Bir bileşen kolondan ne kadar erken çıkarsa, o bileşene ait pik de o kadar keskin elde edilirken, kolondan geç çıkan bileşenlere ait pikler ise geniş ve yayvan olarak elde edilmektedir. Bu ise istenmeyen bir durumdur. Bu durumu önlemek için sıcaklık programlaması yöntemi uygulanır. Baslangıçta kolon sıcaklığı düşük tutulur ve zamanla doğrusal bir biçimde arttırılır.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

b)Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi

HPLC

Sıvı kromatografi bir ayırma tekniğidir. Bir sıvıda çözünmüş ayrılacak bileşenler, bir kolon içerisinde bulunan genellikle katı bir destek üzerindeki sabit faz ile farklı etkileşmelere girerek, kolon içinde değişik hızlarda ilerler. Kolonu değişik zamanlarda terkederler ve böylece birbirlerinden ayrılırlar. Burada taşıyıcı faz olan sıvı, pompalarla kolona basıldığından yüksek akış hızındadır. Bu nedenle ayırma daha kısa sürede ve tam olarak gerçekleşmektedir. Ayrılan bileşik, kolon çıkışına bağlanan uygun bir dedektörle tesbit edilip miktarıyla orantılı olarak kaydedilir. Yüksek hızda gerçekleştirilen ayırmaların yapıldığı sıvı kromatografi sistemlerine, Yüksek Basınç Sıvı Kromatografi (HPSC) denir

Normal Faz Sıvı Kromatografisi:

Polar sabit faz ve apolar veya düşük polariteye sahip hareketli faz

Ters Faz Sıvı Kromatografisi:

Sabit faz apolar, hareketli faz ise polardır


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

Ters faz kromatografisinin avantajları

1. Normal faz kromatografide, sıvı fazın kontrolü çok önemli ve kritiktir.Hareketli faz bileşimindeki küçük değişiklikler kromatogramda belirgin farklılıklara neden olabilir.

2. Dengeye ulaşma normal faz kromatografide çok yavaştır.

3. Normal faz kromatografide polar maddelerin elüsyonu çok yavaştır ve yayvan piklere sebep olu

4. Apolar çözücüler çok pahalıdır, ayrıca nemden uzak tutmak zordur.


Kromatograf k y nteler siniflandirilmasi b lec k eyh edebal n vers tes 2013 2014

HPLC’nin avantajları

• HPLC kolonu, rejenerasyon gerekmeksizin pek çok kez

kullanılabilir.

• HPLC tekniği kullanıcının becerisine daha az bağımlıdır ve

tekrarlanabilirlik daha yüksektir.

• Nicel analiz kullanılabilir.

• Analiz süresi kısadır.

• Duyarlık yüksektir.


  • Login