PASO DE DESACILACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LAS ALDEHÍDO DESHIDROGENASAS

1. PASO DE DESACILACIÓN DE LA REACCIÓN CATALIZADA POR LAS ALDEHÍDO DESHIDROGENASAS González Segura, Lilian, DíazSánchez, Ángel G. y MuñozClares, Rosario A. Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM, México, D. F., 04510, México. Correoelectrónico: lilgonzalezseg@gmail.com Introducción Glu476 Glu476 Glu476 Lys178 Lys178 Lys178 Las aldehído deshidrogenasas (ALDHs) son un grupo de enzimas ampliamente distribuidas que catalizan la oxidación de una gran variedad de aldehídos a sus correspondientes ácidos carboxílicos con la concomitante reducción de NAD(P)+ a NADP(H). El mecanismo de reacción de las aldehído deshidrogenasas involucra tres pasos: a) el ataque nucleofílico de la cisteína catalítica sobre el aldehído formando un intermediario tiohemiacetal; b) la transferencia del hidruro del tiohemiacetal al NAD(P)+ resultando en la formación del intermediario tioéster y NAD(P)H; y c) el ataque nucleofílico de una molécula de agua sobre el intermediario tioéster (desacilación) produciéndose el producto ácido. Glu268 Glu268 Glu268 • Formación del tiohemiacetal NAD(P)+ Phe465 NAD(P)+ Phe465 Phe465 “intermedia” Gly464 Gly464 Gly464 Cys302 Cys302 Cys302 Glu288(268) Intermediario tioéster Glu252(268) Producto ácido Aldehído Intermediario tioéster E E “adentro” “intermedia” Intermediario tiohemiacetal Wat5 Wat5 5.6 Agujero del oxianión 4.1 2.8 Agujero del oxianión 4.2 Wat1 Wat2 “descanso” 6.2 Aldehído 3.2 2.4 (2) Transferencia del hidruro Asn169 Asn169 NAD(P)H Nu– Asn169 Figura 3. Posición de las moléculas de agua hidrolíticas con respecto al intermediario tioéster modelado en el sitio activo. Nuestros modelos indican que sólo tres (Wat1, Wat2 y Wat3) de las cinco moléculas de agua propuestas como hidrolíticas podrían participar en el paso de desacilación ya que están cercanas al glutámico catalítico y podrían acercarse al carbono carbonílico del intermediario tioéster siguiendo la trayectoria ideal de Bürgi-Dunitz. 4.2 (II) Nu– (I) Wat3 (III) 6.3 NAD(P)+ 3.6 Intermediario tioéster Wat4 5.2 1.9 “ataque” Intermediario tioéster 3.3 Esquema 2. Mecanismo del paso de desacilación propuesto para las ALDHs [1]. Ácido NAD(P)H NAD(P)H 3.2 3.1 2.7 Cys286 (302) Cys322 (302) Asn153(169) Asn184(169) TtP5CDh (1UZB) PaBADH (2WME) E E “intermedia” (3) Desacilación Intermediario tioéster Intermediario tetrahédrico “adentro” Valores de pKas teóricos del Glu catalítico y de los residuos involucrados en la liberación del protón “descanso” Las reacciones hidrolíticas catalizadas por enzimas requieren de una base general para aceptar un protón de la molécula de agua hidrolítica. Para una eficiente transferencia de un protón entre dos grupos o moléculas, el pKa del donador y aceptor deben de ser comparables. Esto implica que el pKa de la cadena lateral del Glu catalítico debe ser mayor que su valor típico de 4, mientras que el agua hidrolítica su valor debe ser más bajo que su valor normal de 15.74. Para investigar la factibilidad de que el agua hidrolítica ceda el protón al Glu catalítico y de que éste lo ceda posteriormente a través de un mecanismo que involucra a otro residuo de Glu como se ha propuesto [2], se estimaron valores de pKa teóricos de los grupos carboxilo de ambos residuos de la PaBADH utilizando el programa de cómputo PROPKA 2.0 [3]. Esquema 1. Mecanismo químico de reacción de las aldehído deshidrogenasas [1]. Figura 2. Posiciones e interacciones de moléculas de agua ordenadas que han sido propuestas como hidrolíticas en diferentes ALDHs. Lys178 Las estructuras cristalográficas de las ALDHs han mostrado la flexibilidad conformacional del residuo glutámico catalítico que es la base general que activa la molécula de agua hidrolítica en el paso de desacilación. Glu476 “afuera” “intermedia” Glu268 “adentro” “adentro” Val453 Los cálculos de los pKas teóricos apoyan nuestra hipótesis de que el Glu catalítico sufre cambios importantes en su pKa consistentes con su papel como base general y su papel en el sistema de descarga de protones previamente propuesto por nosotros a partir de observaciones cristalográficas [2]. Esto se logra gracias a los cambios conformacionales que experimenta este residuo durante el ciclo catalítico. “adentro”- conformación del glutámico cercana a la cisteína catalítica. ”intermedia”- conformación en la que podría llevar a cabo la activación de la molécula de agua hidrolítica. “afuera”- conformación en la que libera el protón que había sido tomado previamente a través de un mecanismo de descarga de protones [2]. “descanso” “ataque” Cys302 “ataque” Conclusión El análisis de las estructuras cristalográficas de las ALDHs, el uso de los modelos de los intermediarios catalíticos y los cálculos teóricos de pKas nos han permitido entender mejor el mecanismo del paso de desacilación de la reacción catalizada por estas importantes enzimas. Referencias En base a las estructuras cristalográficas de ALDHs se han propuesto como hidrolíticas cinco moléculas de agua que ocupan distintas posiciones en el sitio activo. El paso de desacilación requiere: (1) que la molécula de agua hidrolítica se encuentre en la posición adecuada con respecto al carbono carbonílico del intermediario tioéster para llevar a cabo un ataque nucleofílico eficiente, siguiendo la trayectoria de Bürgi-Dunitz, así como con respecto al glutamato al que cede un protón activándose, y (2) que este protón sea liberado posteriormente por el glutamato. Para comprobar cuales de estas moléculas cumplían con estos requisitos modelamos el intermediario tioéster en el sitio activo de la betaína aldehído deshidrogenasa de Pseudomonas aeruginosa (PaBADH). • Muñoz-Clares, R. A., González-Segura, L. and Díaz-Sánchez, A. G. (2011) Chem.-Biol. Interact. en prensa. doi: 10.1016/ j.cbi.2010.12.024  • González-Segura, L., Rudiño-Pinera, E., Muñoz-Clares, R. A. and Horjales, E. 2008. (2009) J. Mol. Biol. 385, 542-557. • Li, H., Robertson, A.D. and Jensen, J.H. (2005) Proteins 61, 704-21. Agradecimientos Figura 1. Conformaciones del glutámico catalítico en las ALDHs. Trabajo financiado por CONACYT (proyectos 59654 y 101986) y DGAPA, UNAM (proyecto PAPIIT IN204708).