第十四章
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 148

第十四章 RNA 的生物合成 PowerPoint PPT Presentation


  • 130 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

第十四章 RNA 的生物合成. DNA 转录 RNA 的复制。 RNA DNA RNA. RNA 的生物合成. 转录( transcription): 以一段 DNA 的遗传信息为模板,在 RNA 聚合酶作用下,合成出对应的 RNA 的过程( DNA 指导的 RNA 合成) 。 转录产物: mRNA 、rRNA、 tRNA、 小 RNA

Download Presentation

第十四章 RNA 的生物合成

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Rna

第十四章RNA的生物合成

DNA转录

RNA的复制。

RNA DNA RNA

RNA的生物合成

转录(transcription):以一段DNA的遗传信息为模板,在

RNA聚合酶作用下,合成出对应的RNA的过程(DNA

指导的RNA合成)。

转录产物:mRNA 、rRNA、 tRNA、小RNA

除某些病毒基因组RNA外,绝大多数RNA分子都来自DNA转录的产物。


Rna

第一节、DNA转录

一、转录的单位

转录通常具有一定的起点和终点,这段转录的

区域叫做转录单位。

原核生物 多顺反子

一个转录单位

真核生物 单顺反子

(一)、控制转录的起始区域—启动子

1、启动子定义:RNA聚合酶识别、结合并开始转录所必需的一段DNA序列。


Rna

转录单位


Rna

2、启动子序列的测定—足迹法和DNA测序法

足迹法:即是将DNA起始转录的限制片段分离出来。加RNA聚合酶使之结合。再用DNA酶部分水解。与酶结合的部位被保护而不水解,其余部位水解成长短不同的片段,经凝胶电泳即可测出酶所结合的部位


Rna

(1)、-10序列(Pribnow框):解链区

定义:在转录起点上游大约-10处,有一个6bp的保守序列TATAAT,称Pribnow框。此段序列出现在-4到-13bp之间,解链区决定转录方向。

频度: T89 A89 T50 A65 A65 T100

作用:Pribnow框决定转录方向。酶在此部位与DNA结合形成稳定的复合物,Pribnow框中DNA序列在转录方向上解开,形成开放型起始结构,它是RNA聚合酶牢固的结合位点,是启动子的关键部位。

问题:设计一个探针能够最大数量的与E.coli启动子杂交。

(5-ATTATA-3)


Rna

-10序列对转录的效率影响

  • TATAAT→AATAAT,转录效率下降,称为下降突变(down mutation)。

  • TATGTT→TATATT,转录效率上升,为上升突变(up mutation)。

  • 以上突变为何会影响转录效率?

    (前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆积能,后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少)

据预测,Pribnow框中,一开始的TA和第6位最保守的T在结合RNA聚合酶时起十分重要的作用。


Rna

(2)、 -35序列(Sexfama box):识别区

定义:在-10序列上游一个保守序列,其中心约在-35位置,称为-35序列,此序列为RNA酶的识别区域。(只含-10序列的DNA不能转录)

碱基出现频率:T85 T83 G81 A61 C69 A52 ,其中TTG十分保守。

功能:它是原核RNA聚合酶全酶依靠σ因子的初始识别位点。-35序列的核苷酸结构,在很大程度上决定了启动子的强度,RNA聚合酶易识别强的启动子。

-35序列提供RNA聚合酶识别信号,

-10序列有助于DNA局部双链解开,

-35和-10序列的距离是稳定的,此与RNA pol的结构有关


Rna

(3)、转录起始位点(I)

第一个碱基在原核中常为A或G,而且位置固定


Rna

4、


Rna

真核生物Ⅱ类基因的启动子和调控区

TATA框

核心元件

启始子(initiator,Inr):一般由PY2CAPY5构成,

位于-3~+5 ,可能提供RNA pol Ⅱ识别。

CAAT box、

Ⅱ类启动子 上游元件组成 GC box

Oct

.增强子(enhomcer)

远端调控区 减弱子(dehancer)

静息子(sisencer)

上游激活序列(upstream activating

seguences UASs)


Rna

真核生物Ⅱ类基因的启动子和调控区


Rna

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子

(1)、TATA框(Hogness框):解链区

定义:中心在-25至-30,长度7bp左右。相当于原核的-10序

列。此序列功能使DNA双链解开

碱基频率:T82 A97 A85 A63 (T37 )A83 A50(T37 )(全为A- T,少数含有一个G-C对)。

功能:使DNA双链解开,并决定转录的起点位置,失去TATA框,转录将可能在许多位点上开始。

TATA框的改变或缺失,直接影响DNA与酶的结合程度,会使转录起始点偏移,因此,TATA是绝大多数真核基因正确表达所必需的。


Rna

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子

(2)、CAAT框: 聚合酶识别结合区

中心在-75处,9bp,共有序列GGT(G)CAATCT

功能:与RNA聚合酶结合。

(3)、GC框:

在CAAT框上游,序列GGGCGG,与某些转录因子结合。

CAAT和GC框均为上游序列,对转录的起始频率有较大影响。

(4)增强子

其特点是:

① 具有远距离效应。② 无方向性。③ 顺式调节。

④ 无物种和基因的特异性。⑤ 具有组织的特异性。

⑥ 有相位性。其作用和DNA的构象有关。

⑦ 有的增强子可以对外部信号产生反应。


Rna

启动子比较

真核生物RNA聚合酶Ⅱ的启动子和原核生物RNA聚合酶启动子


Rna

转录因子

RNA聚合酶在进行转录时,常需要一些辅助因子(蛋白质)参与作用,此类蛋白质统称为转录因子。

人类Ⅱ型启动子的转录因子

因子 分子量 功能

RNAPolⅡ ≥10K 依赖模板合成RNA

TFⅡA12,19,35K 稳定TFⅡD和DNA的结合,激活TBP亚基

TFⅡB33K 结合模板链(-10~+10),起始PolⅡ结合,和TFⅡE/F

相互作用

TFⅡD(TBP,30K) TBP亚基识别TATA,将聚合酶组入复合体中,TAFs识别

特殊启动子

TFⅡE34K(β) 结合在PolⅡ的前部,使复合体的保护区延伸到下游

57K(α)

TFⅡF38, 74K 大亚基具解旋酶活性(RAP74),小亚基和PolⅡ结合,

介导其加入复合体

TFⅡH 具激酶活性,可以磷酸化PolⅡC端的CTD,使PolⅡ逸出,延伸


Rna

真核生物转录起始复合物的组装

启动子TATA盒+ TFⅡD

+D-A复合物(TFⅡD+ TFⅡA)

+ TFⅡB

+(RNA聚合酶+ TFⅡF)复合物

+TFⅡE 、TFⅡJ

+TFⅡH(解旋酶、蛋白激酶)

DNA解旋、RNA聚合酶C-端Ser磷酸化

从起始点向下游移动


Rna

真核生物转录起始复合物的组装

TFⅡD

TFⅡB

TFⅡA

TFⅡF

RNA聚合酶

TFⅡE 、

TFⅡJ

TFⅡH


Rna

试解释在真核基因-50位点插入一个5bp的DNA序列比插入一个10bp的DNA序列对RNA聚合酶2的转录起始速率降低的程度影响更大

RNA聚合酶2的启动子除了-27位的(TATA框)外还有-50——-100之间的序列,插入一个10bp序列正

好为一个螺距,和原来的转录因子结合的位点还在

侧,插入一个5bp序列(螺旋半圈),和原来的转录

因子结合的位点在相反一侧


Rna

上游控制元件

核心元件

RNA聚合酶I类启动子

该类启动子最为简单。I类启动子控制的基因只能是rRNA基因。人类细胞中rRNA启动子由两部分组成,① 核心元件,位于转录起始部位前后-45至+20之间,负责转录的起始。② 上游控制元件(upstream control element, UCE),位于上游-180至-107之间,作用是增加核心元件转录起始的效率。这两个启动子元件的序列85%左右相同,其碱基组成的特点是富含G-C配对。


Rna

  • RNA聚合酶I类转录因子

  • 和II类因子相比,I类因子要简单得多,只有SL1和上游结合因子(UBF)两种。

  • ★ SL1

  • SL1由TATA盒结合蛋白(TBP)和三种TAF组成

  • (TAFI110,TAFI63和TAFI48)。

  • SL1自身并不与rRNA启动子结合,但它能够扩大和增强

  • RNA聚合酶I与上游控制元件的结合。

  • ③ SL1有种属的特异性。

  • ★ UBF:UAF能够激活完整的启动子或核心元件,并在上游控制元件的协助下介导激活。

  • UBF和SL1在刺激转录的过程中有协同作用。


Rna

RNA聚合酶I I I类启动子

5sRNA

tRNA

SnRNA


Rna

小节


Rna

(二)、 终止子和终止因子

1、终止子定义:

终止子:提供转录终止信号的一段DNA序列。

终止因子:协助RNA聚合酶识别终止子的蛋白质辅助因子。

2、原核生物的终止因子(terminator factors)

(1).ρ蛋白:这是一种六聚体的蛋白质,亚基的分子量为50kD。该蛋白因子能识别终止信号,并能与RNA紧密结合,导致RNA的释放。

(2). nusA蛋白:为一分子量69kD的酸性蛋白,它能与RNA及RNA聚合酶相结合,在终止部位使两者被释放。


Rna

3、大肠杆菌中的两类终止子

所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构,它转录出来的RNA可以形成一个颈环式的发荚结构。

(1)、不依赖于ρ的终止子(简单终止子)

简单终止子除具有发夹结构外,在终止点前有一寡聚U序列,回文对称区通常有一段富含GC的序列。

寡聚U序列可能提供信号使RNA聚合酶脱离模板。

(2)、依赖ρ的终止子

依赖ρ的终止子,必需在ρ因子存在时,才发生终止作用。终止点前无寡聚U序列,回文对称区不富含GC。

ρ因子是55KD的蛋白质,可水解三磷酸核苷。


Rna

(1)、不依赖于ρ的终止子(简单终止子)

不依赖于ρ因子的终止子(强终止子)的结构特点

(1) 有回文结构存在;

(2) 茎的区域富内含G-C;

(3)强终止子3′端上有6个U;

产物RNA形成茎-环结构是终止的关键,茎环结构使转录终止的机理:

  • 使RNA聚合酶变构,转录停顿;

  • 使转录复合物趋于解离,RNA产物释放

☆ RNA pol变构;RNA局部双链影响DNA-RNA杂化双链

☆ 产物出现一连串U, U :dA配对最不稳定,有利于RNA

从模板脱落。


Rna

不依赖于ρ的终止子(简单终止子)


Rna

(2)依赖ρ因子(rho factor)的终止:

ρ因子是ρ基因编码的蛋白质,是一种酶,它具有ATPase的活性和解链酶的活性,在水解ATP的情况下,它沿着5′→3′方向转录物的3′端前进,直到遇到暂停在终止点位置的RNA聚合酶。随后ρ因子通过解链酶的活性解开转录泡(transcription

bubble)上的RNA/DNA形成的杂交

双螺旋,使RNA转录物得到释放,

从而终止转录。

ρ因子


Rna

大肠杆菌中的两类终止子差别


Rna

4、抗终止作用

通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。

抗终止作用常见于某些噬菌体的时序控制。早期基因于后基因之间以终止子相隔开,通过抗终止作用可以打开后基因的表达。

λ噬菌体前早期(immediate early)基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。它与RNA聚合酶作用使其在左右两个终止子处发生通读,从而表达晚早期(delayed early)基因。晚早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子,它能使晚早期基因得以表达。


Rna

(三)转录的不对称性


Rna

转录的不对称性


Rna

转录的不对称性


Rna

确定有义链

J.Marmur和Doty Spiegelnan区分有义链。采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料,SP8 DNA 双链有“ 轻”、“ 重”差异明显。


Rna

二、RNA聚合酶 (RNA-pol)


Rna

原核生物的聚合酶

由五个亚基组成


Rna

E.coli RNA聚合酶(原核)

E.coli和其它原核细胞只有一种RNA聚合酶,合成各种RNA(mRNA、tRNA、rRNA)

1、σ亚基的功能:无σ亚基的酶叫核心酶,核心酶只能使已开始合成的RNA链延长,而不具备起始合成活性,加入σ亚基后,全酶才具有起始合成RNA的能力,因此,σ亚基称为起始因子。核心酶在DNA上滑动,σ亚基能增加酶与DNA启动子的结合常数,增加停留时间,使聚合酶迅速找到启动子并与之结合,σ亚基本身无催化活性。不同的σ因子识别不同的启动子,从而表达不同的基因。不同的原核生物,都具有相同的核心酶,但σ亚基有差别,这决定了原核基因表达的选择性。


Rna

不同σ因子识别不同启动子


Rna

E.coli RNA聚合酶(原核)

2、β亚基:是酶和底物结合的部位和催化位点。利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)通过结合β亚基,对全酶有强烈的抑制作用,抑制RNA合成的起始,但不抑制其延长。β亚基基因rpoB突变可使细菌对利福平有抗性。

3、β’亚基:其作用是与模板DNA相结合。β’亚基的碱性较强,适于与模板DNA相结合。肝素是一种多价阴离子,能和β‘亚基结合,从而抑制DNA与RNA聚合酶结合,进一步抑制转录作用。

4、α亚基:功能现尚未知。然而,当噬菌体T4感染E.coli时,其α亚基即在精氨酸上被ADP-核糖化。这种修饰作用使该RNA聚合酶全酶对其原先识别的启动子的亲和力减弱。所以有人认为,α亚基的功能可能参与全酶和启动子的牢固结合。


Rna

细菌RNA聚合酶特点

1. 聚合速率慢,30-85NTP/秒

2. 缺乏外切酶活性,无校对功能,错误率10-6

3. 不同的σ因子识别不同的启动子

4. 可被药物抑制(利福平)

人的RNA聚合酶对利福平不敏感。利用此特点可研制杀菌药物


Rna

大肠杆菌RNA聚合酶与DNA的相互作用


Rna

纯的RNA聚合酶,在离体条件下可转录双链DNA,但在体内,DNA的两条链中只有一条可用于转录,这可能是由于RNA聚合酶在分离时丢失了σ亚基引起的或者DNA提取过程中因断裂失去了控制序列。

解旋和重新螺旋化也是RNA聚合酶的内在特性,在酶的前端解螺旋,在后端以相反方向重新螺旋化,活体状况中,可能还有其它酶活性来帮助调整DNA的拓扑学性质。

37℃时,RNA聚合酶的聚合速度可达50个核苷酸/秒

与蛋白质翻译速率15个氨基酸/秒相仿

但是慢于DNA复制的速率800bp /秒


Rna

原核生物RNA pol执行多功能

(1) 识别DNA双链上的启动子;

(2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链;

(3) 通过阅读启动子序列,RNA pol确定它

自己的转录方向和模板链。

(4) 最后当它达到终止子时,通过识别停止转录。


Rna

(三)、 噬菌体T3和T7编码的RNA聚合酶

仅为一条分子量11KD的多肽链,这些聚合酶只需要识别噬菌体DNA的少数启动子,并无选择地与其作用,它们能很快合成RNA,其速率在37℃时可达约200核苷酸/秒。轉錄 反應時所需辨認的promoter長度僅20 bp左右,加上轉錄起始位置明確,轉錄效能良好,成了目前進行胞外轉錄反應時的最佳選擇。


Rna

三、RNA合成的基本特征

模板

原料

产物

配对

方向

引物

DNA(不对称转录)

NTP

RNA聚合酶

mRNA,tRNA,rRNA,小RNA

A-U,T-A,G-C

5’ 3’

不需要

转录为全保留(DNA复制为半保留)


Rna

  • mRNA的合成总是延着5-3′方向进行的?


Rna

RNA聚合酶催化的反应


Rna

(真核细胞为转录因子的装配阶段)


Rna

1、转录的起始过程

(1).全酶与模板的DNA接触,生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动;

(2). 起始识别:全酶与-35序列结合,产生封闭的酶-启动子二元复合物(closed binary complex);

(3).全酶紧密地结合在-10序列处,模板DNA局部变性,形成开放的启动子二元复合体;

(4)第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体(ternary complex)。

在新合成的RNA链的5’末端,通常为pppG或pppA,即合成的第一个底物是GTP或ATP。起始过程中,σ因子起关键作用。


Rna

2、延长-转录泡

转录起始后,σ亚基释放,离开核心酶,使核心酶的β’亚基构象变化,与DNA模板亲和力下降,在DNA上移动速度加快,使RNA链不断延长。

σ亚基从全酶中解离出来后,nusA亚基结合到核心酶上,由nusA亚基识别序列序列。

RNA聚合酶(核心酶)◆ 与DNA模板紧密结合,沿3’→5’方向移动转录产物RNA沿5’ 3’方向延长

 ◆ 解旋作用:DNA解开17 bp,12bp长的杂交螺旋 ◆ 聚合功能(不具外切酶功能)


Rna

3、终止

RNA聚合酶到达转录终止点(终止子区)时,在终止辅助因子的帮助下,聚合反应停止,RNA链和聚合酶脱离DNA模板链,nusA又被σ亚基所取代。

由此形成RNA聚合酶起始复合物与终止复合物两种形式的循环。


Rna

终止过程


Rna

终止过程


Rna

2


Rna

DNA

RNA

5

3

RNA聚合酶

核糖体

原核生物转录过程中的羽毛状现象


Rna

五、转录与DNA复制的异同:相同


Rna

转录与DNA复制的异同:差异


Rna

真核生物的转录和原核转录的不同点:

(1) 原核只有一种RNA聚合酶,而真核细胞有三

种聚合酶;

(2) 启动子的结构特点不同,真核有三种不同的

启动子和有关的元件;

(3) 真核的转录有很多蛋白质因子的介入。

(4) 原核细胞靠RNA pol本身可识别启动子,而真核

细胞 的RNApol无法识别启动子,要靠转录因

子 (TF)识别启动子 ,有许多转录因子


Rna

六、    RNA生物合成的抑制剂

某些核酸代谢的拮抗物和抗生素可抑制核苷酸或核酸的合成,因而可以用于抗病毒或抗肿瘤药物,也可以用于核酸的研究

1、嘌呤和嘧啶类似物

抑制核苷酸的合成,还能掺入核酸分子中去,形

成异常DNA、RNA,影响核酸功能。

主要有:6-巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、

8-氮鸟嘌呤、5-氟尿嘧啶 、6-氮尿嘧啶

碱基类似物进入体内后需转变成相应的核苷酸,才表现出抑制作用。


Rna

2、DNA模板功能的抑制剂

此类化合物能与DNA结合,使DNA失去模板功能,从而抑制其复制与转录。

(1)、烷化剂

氮芥(二(氯乙基)胺的衍生物)、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺类。它们带有活性烷基,使DNA烷基化。

烷化位点:鸟嘌呤N7 ,腺嘌呤N1、N3、N7,胞嘧啶N1

影响:碱基易被水解下来,留下的空隙可干扰DNA复制或引起错误碱基掺入。带有双功能基团的烷化剂,可同时与DNA两条链结合,使双链DNA交联,从而失去模板功能。


Rna

DNA模板功能的抑制剂

(2)放线菌素D(对真核、原核细胞都起作用)

有抗菌和抗癌作用。

它可与DNA形成非共价复合物(插入两个连续G=C之间),使其多肽部分在DNA的“浅沟”上如同阻遏蛋白一样,抑制DNA的转录和复制。

此类机理的放线菌素还有色霉素A3、橄榄霉素、光神霉素。

(3)、嵌入染料

扁平芳香族染料,可插入双链DNA相邻碱基对之间。

溴化乙锭插入后,使DNA在复制时缺失或增添一个核苷酸,从而导致移码突变,并能抑制RNA链的起始及质粒的复制。此外还有原黄素、吖啶黄、吖啶橙等。


Rna

3、RNA聚合酶的抑制物

(1)、利福霉素( 和β亚基结合)

包括其衍生物利福平,特异地抑制细菌RNA聚合酶的活性。

强烈抑制革兰氏阳性菌和结核杆菌,它主要抑制RNA合成的起始。

(2)、利链菌素

与细菌RNA聚合酶β亚基结合,抑制转录过程中链的延长。

(3)、α-鹅膏蕈碱

主要抑制真核RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ,对细菌的RNA聚合酶作用极小

问题:抗生素蛹虫虫草菌素为腺苷3`脱氧类似物,试解释它的作用机理。(没有3`-OH)


Rna

转录的抑制作用

  • 与DNA模板作用

  • 与RNA聚合酶作用

  • 原核生物

  • 真核生物

  • 放线菌素D--插入dG*dC间

  • 低浓度--(-)RNA延长

  • 高浓度--(-)RNA起始

    (-)DNA复制

  • 利福平/利福霉素

  • 和原核生物RNA聚合酶

    β亚基结合--(-)转录起始

  • α鹅膏蕈碱

    --(-)RNA聚合酶Ⅱ

  • 原核生物、真核生物均起作用


Rna

RNA转录后的加工

(一)RNA转录后的加工定义:RNA聚合酶合成的原初转录产物,要经过剪切、修饰、拼接等过程,才能转变成成熟的RNA分子,此过程称RNA转录后的加工。

  • 1、原核、真核的tRNA、rRNA

  • 细胞内的tRNA、rRNA相对稳定,半衰期一般为几个小时。

  • 所有tRNA、rRNA都是由原初转录产物经过一系列加工形成的

  • 原初转录产物的5’是三磷酸(pppG、pppA),而成熟的tRNA、

  • rRNA ,5’是单磷酸。

  • b. 成熟 tRNA、rRNA分子都比原初转录物小。

  • c. 所有的tRNA分子,都有原初转录物所没有的稀有碱基(A、G

  • C、U以外的碱基)。


Rna

2、


Rna

(二)、原核生物RNA的加工


Rna

原核rRNA前体的加工

  • 原核生物rRNA转录初始物:

  • rRNA基因和tRNA基因混合组成一个操纵子:

    16SrDNAtDNA23SrDNA5SrDNAtDNA

  • rRNA转录初始物:

    16SrRNAtRNA23SrRNA5SrRNAtRNA

  • 加工

  • RNA酶Ⅲ对转录初始物切割

  • 再加工成熟


Rna

2、原核tRNA前体的加工

tRNA基因大多成簇存在,或与rRNA基因,或与蛋白质基因组成混合转录单位。 E.coli染色体基因组有60个tRNA基因。

  • 原核生物tRNA转录初始物:

  • tRNA基因:

    ◆Ⅰ型--- tRNA 有 3’-CCA-OH

    ◆Ⅱ型--- tRNA 无 3’-CCA-OH

  • tRNA转录初始物:

    ◆与rRNA相连

    ◆几个相同(不同)tRNA连在一起


Rna

tRNA前体加工步骤:

a.核酸内切酶(RNAaseP、RNAaseF)在tRNA两端切断。

b.核酸外切酶(RNAaseD)从3’端逐个切去附加序列。

c.tRNA核苷酰转移酶在tRNA3’端加上-CCA-OH。

d.核苷的修饰(修饰酶):甲基化酶 / S-腺苷蛋氨酸

(SAM),假尿苷合成酶。


Rna

tRNA前体加工步骤:


Rna

有些多顺反子构成的mRNA,须由核酸内切酶切成较小的mRNA,然后再进行翻译。

例:核糖体大亚基蛋白L10、L7、L12与RNA聚合酶β、β’亚基的基因组成混合操纵子。它在转录出多顺反子mRNA后,由RNAaseⅢ将核糖体蛋白质基因与聚合酶亚基基因的mRNA切开,然后各自翻译。

该加工过程的意义:可对mRNA的翻译进行调节,核糖体蛋白质的合成必须适应于rRNA的合成水平,而细胞内RNA聚合酶的合成水平则要低得多。两者切开,有利于各自的翻译调控。


Rna

二、真核生物RNA的加工

真核rRNA、tRNA前体的加工过程与原核的很相似,但mRNA的加工过程与原核的有很大不同。

1、真核rRNA前体的加工

真核rRNA基因也成簇排列在一起,18S、5.8S、28S rRNA基因组成一个转录单位,彼此被间隔区分开,由RNA聚合酶I转录生成一个长的rRNA前体。5SrRNA基因也成簇排列,间隔区不被转录,由RNA聚合酶III转录后经适当加工。

★哺乳动物:45SrRNA前体,含18S、5.8S、28S rRNA

果蝇:38SrRNA前体,含18S、5.8S、28S rRNA

酵母:37SrRNA 前体,17S、5.8S、26S rRNA


Rna

甲基化位点主要在核糖2’-OH上

真核生物的核仁是rRNA合成、加工和装配成核糖体的场所,大、小亚基分别组装后,通过核孔转移到胞质中


Rna

2、   真核tRNA前体的加工

★ 真核tRNA基因的数目比原核tRNA的要多的多。例如,E.coli有60个tRNA基因,啤酒酵母250个,果蝇850个,爪蟾1150个,人1300个。

★ 真核tRNA基因也成簇排列,被间隔区分开,tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ转录。

★真核tRNA前体的剪切、修饰过程与原核相似。

1)核酸内切酶:在tRNA两端切断(cutting)

2) 核酸外切酶:从端逐个切去附加的顺序,进行

修剪(trimming)

3)3,端加上-CCA-OH(有一类tRNA本身就有,切

去附加序列则露出)

4) 核苷的修饰(成熟tRNA众多修饰成分,甲基


Rna

  • 碱基修饰

  • 3’端

  • 5’端

  • 切除反密码环

    的内含子

  • 转位 --- ψ

  • 脱氨 --- AMP IMP

  • 还原 --- DHU

  • 甲基化--- mA mG

  • CCA-OH

  • RNaseP切除多余的核苷酸

  • RNaseP

    在前tRNA二级结构基础上


Rna

tRNA中的修饰碱基


Rna

3、   真核生物mRNA前体的加工


Rna

(1)、 5’末端加帽

真核生物成熟mRNA两端均为-OH


Rna

参与的酶:RNA三磷酸酶,mRNA鸟苷酰转移酶,mRNA(鸟嘌呤-7)甲基转移酶,mRNA(核苷-2’)甲基转移酶。

由于甲基化的程度不同,有三种类型的帽子:CAP O型,CAP I型,CAP II型。

★5’帽子也出现于hnRNA,说明加帽过程可能在转录的早期阶段或转录终止前就已完成。

★5’帽子的功能

  • 在翻译过程中起信号识别作用,协助核糖体

    与mRNA结合,使翻译从AUG开始。

    b. 保护mRNA,避免5’端受核酸外切酶的降解。


Rna

(2).3’端加尾polyA

3’脱氧腺苷(既冬虫夏草素)是多聚腺苷酸化的特异抑制剂,但它不抑制hnRNA的转录。


Rna

加尾过程:hnRNA链由RNAaseⅢ切断,由多聚腺苷酸聚合酶催化,加上polyA,ATP为供体。(细胞核内完成)

加尾信号:AAUAAA、。高等真核生物和病毒的mRNA在靠近3’端区都有一段非常保守的序列AAUAAA,这一序列离多聚腺苷酸加入位点的距离在11-30nt范围之内。

加尾信号时间:核内hnRNA的3’端也有多聚腺苷酸,表明加尾过程早在核内已经完成。hnRNA中的poly(A)比mRNA略长,平均150-200nt。

★polyA的功能:

a.防止核酸外切酶对mRNA信息序列的降解,起缓冲作用

polyA的结构与mRNA寿命有关。新合成的mRNA的polyA较长,衰老的mRNA分子,polyA短

b. 与mRNA从细胞核转移到细胞质有关。


Rna

Poly(A)的应用:

(a)分离纯化RNA


Rna

Poly(A)的应用

(b)cDNA合成


Rna

(3).  mRNA甲基化

某些真核mRNA内部有甲基化的位点,主要是在N6-甲基腺嘌呤(m6A)。

snRNA

小分子核糖核酸蛋白体

(并接体, splicesome)

核内的蛋白质

(4)mRNA的剪接:除去hnRNA中的内含子,将外显子连接。

.hnRNA 和 snRNA

  • 核内的初级mRNA称为杂化核RNA (hetero-nuclear RNA, hnRNA)

  • snRNA (small nuclear RNA)


Rna

★ mRNA前体拼接的机制

首先在内含子的左端切开,同左面的外显子分离,内含子左端产生的5`端通过2`-5`磷酸二酯键,与内含子右端上游区大约30bp处的分支点A形成一个套索(Lariat structure),然后切开右边内含子-外显子连接处,最后两个外显子连接起来。

重要的snRNA有U系列snRNA,因其尿嘧啶含量高而得名。U系列snRNA通常都与多肽或蛋白质结合形成核糖核蛋白颗粒(RNP)。

U-snRNA参与hnRNA的拼接过程。U3-snRNA与rRNA前体的加工有关,U1、U2、U4、U5、U6可能都与hnRNA的加工有关。


Rna

  • 套索的形成及剪除机制——二次磷酸酯转移


Rna

剪接体 :snRNA和核内蛋白质构成的小分子核糖核蛋白体(snRNP), 能结合hnRNA内含子区段,使内含子弯曲,3´和5´靠近,利于剪接。


Rna

mRNA前体拼接的机制(1)


Rna

mRNA前体拼接的机制(2)


Rna

mRNA前体拼接的机制(3)


Rna

附1、四膜虫rRNA前体的自我拼接

四膜虫35S rRNA前体,经加工可以生成5.8S 、17S和26SrRNA。

某些品系的四膜虫在其26S rRNA基因中有一个内含子,35S rRNA前体需要拼接除去内含子。该拼接过程只需一价和二价阳离子和鸟苷酸(提供3’-OH),无需能量和酶,称为自我拼接

(一)


Rna

八、RNA的复制

有些RNA病毒,进入寄主细胞后,借助复制酶而进行RNA病毒的复制。

RNA病毒的RNA复制酶具有很强的模板特异性,只识别病毒自身的RNA,它以病毒RNA为模板,合成与模板性质相同的RNA。


Rna

(一)噬菌体QβRNA的复制

噬菌体Qβ结构:直径20nm,正十二面体,含30%RNA,其余为蛋白质,单链RNA,4500个核苷酸,编码3-4个蛋白质。

RNA结构:5’端——成熟蛋白(A或A2蛋白)——外壳蛋白(或A1蛋白)——复制酶β亚基——3’端


Rna

Qβ复制酶:αβγδ四个亚基,只有β是自己编码,其余三个亚基来自寄主细胞。


Rna

★ 噬菌体QβRNA的复制


Rna

  • 当噬菌体RNA侵入大肠杆菌后,其RNA即为

  • mRNA,可直接进行与病毒繁殖有关的蛋白质的合成,包括复制酶β 亚基。

  • 通常把具有mRNA功能的链称为正链,而其互

  • 补链为负链。

  • 复制酶装配好后,就结合到正链的3′末端,以

  • 正链为模板合成出负链RNA。当负链合成后,复

  • 制酶和负链RNA都从模板中释放。

  • 复制酶又与负链RNA的3′末端结合,以负链

  • RNA为模板合成正链RNA。


Rna

★QβRNA翻译和复制的自我调节

QβRNA的高级结构(双螺旋区的结构)参与翻译的调节控制:

(1)只有刚复制的QβRNA,成熟蛋白基因才能翻译。

(2)核糖体能直接启动外壳蛋白基因的翻译

(3)复制酶β亚基基因只有在外壳蛋白合成时双链打开才能进行翻译。

★QβRNA的翻译、复制还受寄主细胞调节:

以正链RNA为模板复制负链RNA时,另需寄主细胞的HFⅠ和HFⅡ因子。而以负链RNA 为模板复制正链RNA时,不需这两个因子,因此感染后期大量合成的是正链RNA。


Rna

(二)


Rna

(二)、病毒RNA复制的主要方式

1、正链RNA病毒(mRNA):噬菌体Qβ、灰质炎病毒

进入寄主细胞后,利用寄主的翻译系统,首先合成复制酶及有关的蛋白质,然后进行病毒RNA的复制,最后由病毒RNA和蛋白质装配成病毒颗粒。

 2、负链RNA病毒(带有复制酶):狂犬病毒等

此类病毒带有复制酶,侵入后,复制酶首先合成出正链RNA(mRNA),再以正链RNA为模板,合成负链RNA及蛋白质,然后装配。


Rna

3、双链RNA病毒(带有复制酶):呼肠孤病毒

以双链RNA为模板,在复制酶作用下先转录正链RNA(mRNA),从而翻译出蛋白质,然后合成负链RNA,形成双链RNA,再包装。

4 反转录病毒(含反转录酶):白血病病毒、肉瘤

病毒等致癌RNA病毒

正链RNA病毒,它们的复制需要经过DNA前病

毒阶段。


Rna

不同RNA病毒合成mRNA的途径可以分4类:


Rna

哺乳动物病毒的 mRNA,其 3‘-端和 5’-端与真核 mRNA的 3‘-端和 5’-端修饰的方式类似,为什么?

病毒需使用宿主细胞中的酶系去复制自身的DNA,进而合成自身的蛋白质。由于真核的翻译系统必须合成病毒的蛋白质,因此,病毒mRNA的结构必然是宿主mRNA的仿制品。

预计在真核生物RNA转录物中的5'(AAUAAA)顺序突变可能造成的影响。

由于AAUAAA是真核mRNA正确切除初始转录 3'一末端并加接poly(A),如果它的186突变将导致mRNA成熟,即正确的切割和poly(A)的加接受到抑制和阻断。


Rna

RNA world

  • 地球上第一个出现的能自我复制的分子是RNA

  • 远古时代生命的主要形式就是RNA分子的各种活动, 切割/剪接/复制/与其他分子的相互作用, etc;

  • RNA上的遗传信息反转录到了更稳定的载体-----DNA 上;

  • 复杂性进一步加大,核酸与蛋白质发生了遭遇;

  • RNA世界的影响至今还在,核糖体中核糖的作用,snRNP中RNA的作用,etc


Rna

2006年诺贝尔生理学或医学奖


Rna

RNAi (RNA interference)

瑞典卡罗林斯卡医学院宣布,将2006年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家安德鲁·菲尔和克雷格·梅洛,以表彰他们发现了RNA干扰现象。     植物、动物、人类都存在RNA干扰现象,这对于基因表达的管理、参与对病毒感染的防护、控制活跃基因具有重要意义。RNA干扰已经作为一种强大的“基因沉默”技术而出现。这项技术被用于全球的实验室来确定各种病症中哪种基因起到了重要作用。RNA干扰作为研究基因运行的一种研究方法已被广泛应用于基础科学,它可能在将来产生新的治疗方法。


Rna

RNAi的原理与机制

  • 第一步(起始阶段)首先外源性或细胞内源性的与胞内的dsRNA与细胞内的RNAi核酸酶(如Dicer)相结合,之后dsRNA被核酸酶切割成21~23nt的小干扰RNA (siRNA)。

  • 第二步(效应阶段)是siRNA在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链,并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)。


Rna

RNAi的原理与机制

RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA,并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA,最后可能再被核酸外切酶进一步降解,从而干扰基因表达。


Rna

RNA干扰的作用机制


Rna

RNA干扰的作用机制

siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA,而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA,新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA,从而使RNAi的作用进一步放大,最终将靶mRNA完全降解。

RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是,由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性,任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制


Rna

RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征:

① RNAi是转录后水平的基因沉默机制;② RNAi具有很高的特异性,只降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA; ③ RNAi抑制基因表达具有很高的效率,表型可以达到缺失突变体表型的程度,而且相对很少量的dsRNA分子(数量远远少于内源mRNA的数量)就能完全抑制相应基因的表达,是以催化放大的方式进行的;


Rna

RNAi干扰现象具有以下几个重要的特征:

④ RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限,在不同细胞间长距离传递和维持信号甚至传播至整个有机体以及可遗传等特点; ⑤ dsRNA不得短于21个碱基,并且长链dsRNA也在细胞内被Dicer酶切割为21 bp左右的siRNA,并由siRNA来介导mRNA切割。而且大于30 bp的dsRNA不能在哺乳动物中诱导特异的RNA干扰,而是细胞非特异性和全面的基因表达受抑和凋亡;⑥ ATP依赖性:在去除ATP的样品中RNA干扰现象降低或消失显示RNA干扰是一个ATP依赖的过程。可能是Diecer和RISC的酶切反应必须由ATP提供能量


Rna

RNA干扰的应用


Rna

RNA干扰的应用

3.1 研究基因功能的新工具 由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰活力,可以特异地使特定基因沉默,获得功能丧失或降低突变,因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。已有研究表明RNAi能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达,制作多种表型,而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段,产生类似基因敲除的效应。与传统的基因敲除技术相比,这一技术具有投入少,周期短,操作简单等优势,近来RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道日益增多,标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。 3.2 遗传性疾病的治疗美国西北大学的Carthew R W和日本基因研究所的Ishizuka A等人现RNAi同脆性X染色体综合征(与FMR-1基因异常有关的导致智力低下的染色体病)之间的关系密切,揭示了与RNAi相关机制的缺陷可能导致人类疾病的病理机制。遗传性疾病的RNAi治疗成为当今研究RNAi的又一大热点。


Rna

RNA干扰的应用

3.3 病毒性疾病的治疗

加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的lenti病毒载体引入siRNA,激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5进入人体外周T淋巴细胞,而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CCR4,从而使以lenti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答,由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。RNAi还可应用于其它病毒感染如脊髓灰质炎病毒等,siRNA已证实介导人类细胞的细胞间抗病毒免疫,用siRNA对Magi细胞进行预处理可使其对病毒的抵抗能力增强。


Rna

RNA干扰的应用

3.4 肿瘤病的治疗 肿瘤是多个基因相互作用的基因网络调控的结果,传统技术诱发的单一癌基因的阻断不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长,而RNAi可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,设计针对这一区段序列的dsRNA分子,只注射一种dsRNA即可以产生多个基因同时剔除的表现,也可以同时注射多种dsRNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。Maen等应用RNAi技术成功地阻断了MCF7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。


  • Login