Massenspektrometrie – eine Einführung
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Massenspektrometrie – eine Einführung. H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie. Wozu dient die Massenspektrometrie?. Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen. In einem Bereich von 1Da..>100kDa. Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm.

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Presentation Transcript

Massenspektrometrie – eine Einführung

H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie


Wozu dient die Massenspektrometrie?

Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen.

In einem Bereich von 1Da..>100kDa

Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm

Von Probenmengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g

Über Fragmentierungen erhält man Strukturhinweise

Mir ihrer Hilfe kann man die Menge von Verbindungen bestimmen.

Durch die Massenselektivität gelingt das auch in Gegenwart vonBeimengungen (mit anderer Masse).

Von Mengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g


Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Was sind die Voraussetzungen für eine MS-Messung?

  • Die Moleküle müssen vereinzelt, d.h. von ihresgleichen und von allen anderen abgetrennt werden. Wechselwirkungen würden die Massenbestimmung stören.

  • Die Moleküle müssen ionisiert werden. Die Ladung dient als „Griff“ um Kräfte auf das Molekül auszuüben.


MS

GC

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Verdampfen der Probe ins Hochvakuum – Direkteinlass, Tiegeleinlass,direct inlet, „Schubstange“

Kopplung eines Gaschromatographen mit einem Massenspektrometer – GC-MS


Radikalkationen

+•

Ins Vakuum einschleusen

Verdampfen

Ionisieren

+

Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum

EI


0V

positive Spannung fürpositive Ionen

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Elektronenionisation* - EI

10-5..10-7mBar

Turbomolekularpumpe

* Die veraltete Bezeichnung ist Elektronenstossionisation


Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Elektronenionisation* - EI

  • Bei der (EI) wird die Substanz im Hochvakuum mit 70eV Elektronen beschossen. Der größte Teil der Energie wird nicht auf das Molekül übertragen. Lediglich 6-10eV dienen zur Ionisation nach dem Schema:

    • M + e- M+. + 2e-

  • Darüber hinaus werden noch 2-10eV Energie (sog. Überschußenergie) auf das Molekül übertragen. Das führt zur Anregung des Moleküls und zur Fragmentierung.

  • Ein EI-Spektrum ist die Auftragung derHäufigkeit der im Zeitraum von 10-8 sgebildeten Ionen gegen ihren m/z Wert(bei z=1 entspricht das der Masse).


    Detektor

    Ionenbahnen

    Substanzeinlass

    Ionenquelle

    Analysator

    Detektor

    Quadrupolanalysator (Quadrupolmassenfilter)

    Quadrupolstäbe

    Wechselspannung

    m/z zu klein

    Ioneneintritt

    m/z passend

    m/z zu gross


    Substanzeinlass

    Ionenquelle

    Analysator

    Detektor

    Sekundärelektronenvervielfacher SEV, secondary electron multiplier SEM

    Elektronen

    Ionen

    V 100V

    Hoher Verstärkungsfaktor >106geringes Eigenrauschen, schnell.


    Die Peakhöhe wird auf den intensivsten Peak (100%) normiert.

    Die Peaks haben eine Breite, die von der instrumentellen Massenauflösung abhängt.

    Die x-Achse ist eine m/z Skala!

    Oft werden die Rohdaten in ein Strichspektrumumgerechnet. Hier kann es zu Rundungs-problemen kommen

    Das erste Ergebnis jeder Messung ist ein „Rohspektrum“

    Die angezeigten Massenwerte stellen die Schwerpunkte oder die Maximalwerte der Rohdatenpeaks dar.


    Isotopie und Atomgewichte normiert.alle Angaben in Dalton (Da)

    12C 98,9%

    35Cl 75,7%

    79Br 50,7%

    81Br 49,3%

    1H 99.998%

    37Cl 24,3%

    13C 1,1%

    2H 0.015%

    Kohlenstoff

    Chlor

    Brom

    Wasserstoff

    Das stöchiometrische Atomgewicht (average mass) ist das gewichtete Mittel der Isotopeneinzelgewichte

    12,011 35,46 79,9 1,0079

    Auch die Massen der reinen Isotope sind nicht ganzzahlig (Ausnahme 12C)

    12,0000034,968378,917791,007813,00281 2,0141 36,96535 80,91574


    72 normiert.

    76

    155

    157

    192

    190

    194

    73

    77

    158

    C6

    C6H4

    C6H4Br

    C6H4BrCl

    Molekülionen sind meist eine Gruppe von Peaks, sie entsteht durch die Kombination der natürlichen Isotopen der beteiligten Elemente.

    Schrittweiser Aufbau des Isotopenclusters von C6H4BrCl


    Molekulargewichtsdefinitionen (nach IUPAC) normiert.

    Das stöchiometrisches Molekulargewicht (average mass) ist die Summe der Atomgewichte. Darin sind die mit ihrer Häufigkeit gewichteten Isotope in ihrer natürlichen Verteilung enthalten.

    Das nominale Molekulargewicht ist die Summe der gerundeten Isotopenmassen (der häufigsten Isotope).

    Das „monoisotopische Ion“ ist die Kombination der häufigsten Isotope. Es ist nicht notwendigerweiseder intensivste Peak eines Isotopenclusters.

    Eine Massenangabe wird als „exakte Masse“ bezeichnet, wenn sie mit einer Präzision von +-5ppm(oder +-5mDa) bestimmt oder berechnet wurde.

    Beispiel C6H4BrCl

    average 191.459

    nominal 190

    nominal 192

    exakte Massen 191.91499 12C61H437Cl79Br 191.9159012C61H435Cl81Br

    monoistopisch 189.9179

    bei nicht ausreichender Auflösung wird der Summenpeak mit m/z 191.9156 gefunden


    Unregistered normiert.

    100

    90

    80

    70

    C19H36O C20H40

    60

    m/z

    280.31300281.31645282.31993

    m/z280.27661281.28003282.28319

    50

    40

    Unregistered

    100

    30

    90

    20

    80

    10

    70

    0

    280

    281

    282

    283

    284

    60

    50

    40

    30

    20

    10

    0

    280

    281

    282

    283

    284

    Hochauflösung

    Befinden sich auf der gleichen Nominalmasse zwei oder mehr Ionen verschiedenerElementarzusammensetzung, so muß die Auflösung des Massenspektrometers besonderserhöht werden, um diese unabhängig voneinander bestimmen zu können.

    Bei Werten von R10%Tal > 10.000 spricht man von Hochauflösung.

    Massenunterschied 0,037Da

    notwendige Auflösung 280/0,037= 7500


    . normiert.CH3

    CO

    C2H4

    HCl

    EI-Spektrum - Interpretationsansatz

    CH3CO+

    C3H7+

    Skyline

    wohldefinierte Bruchstellen

    Molekülion

    m/z 154/155/156/157

    Isotopenmuster

    enthält 1 Chloratom

    Fragmentierungen

    M-15, M-15-28, M-15-28-36

    charakteristische Ionen

    m/z 38/39; 50..52; 62..65; 74..78

    Alle EI-Beispielspektren sind der NIST Datensammlung entnommen


    Bildung stabiler Kationen normiert.

    Abspaltung günstiger (=stabiler) Radikale

    Abspaltung stabiler (kleiner) Neutralteilchen

    Was bestimmt den Zerfall von angeregten Radikalkationen?


    Beispiel 1 normiert.

    m/z 101

    α-Spaltung

    m/z 86

    m/z 58

    m/z 30


    Stickstoffsregel normiert.

    Ist das Molekülion geradzahlig, so enthält das Molekül eine gerade Anzahl von N-Atomen (oder keine).

    Ist das Molekülion ungeradzahlig enthält es eine ungerade Zahl von N-Atomen

    Doppelbindungsregel

    nC, nH, nN = Anzahl der Atome

    Die Zahl der Doppelbindungen und/oder Ringe lässt sich folgendermassen berechnen:

    Wenn Stickstoff anwesend ist, muss das berücksichtigt werden:


    Beispiel 2 normiert.

    m/z 142

    m/z 71

    m/z 57

    Keine Abspaltungen von CH2 sondern vonEthen, Propen, Buten usw.

    m/z 29


    Beispiel 3 normiert.

    m/z 134

    m/z 91

    McLafferty Umlagerung

    m/z 92


    Beispiel 4 normiert.

    McLafferty Umlagerung:

    das ML-Ion beinhaltet die Alkoholseite und die Position 2 des Esters.

    Substitution an diesen Positionen verschiebt das Produktion.

    m/z 74


    Beispiel 5 normiert.

    Diese Verbindung enthält nur 1 Heteroatom.


    Massenspektrometrie – eine Einführung normiert.

    139

    100

    50

    111

    182

    31

    43

    77

    50

    69

    85

    125

    147

    165

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    140

    160

    180

    200

    Beispiel 6

    EI-Spektrum

    m/z

    Molekulargewicht

    m/z 182

    Skyline

    wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139

    Auffällige Isotopenmuster

    bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.


    Massenspektrometrie – eine Einführung normiert.

    139

    100

    50

    111

    182

    31

    43

    77

    50

    69

    85

    125

    147

    165

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    140

    160

    180

    200

    Beispiel 6

    DBE = ((2*Zahl der C-Atome + 2)-Zahl der H-Atome)/2

    Cl zählt als einbindiges Atom wie ein H.

    EI-Spektrum

    m/z

    Molekulargewicht

    m/z 182

    Skyline

    wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139

    Auffällige Isotopenmuster

    bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

    Summenformel

    C8H19ClO2

    C9 H7 Cl O2

    C10H11ClO

    C11H15Cl

    „übersättigt“ maximal wäre H17

    6 Doppelbindungsäquivalente

    5 Doppelbindungsäquivalente

    4 Doppelbindungsäquivalente


    Massenspektrometrie – eine Einführung normiert.

    139

    100

    50

    111

    182

    31

    43

    77

    50

    69

    85

    125

    147

    165

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    140

    160

    180

    200

    Beispiel 6

    EI-Spektrum

    m/z

    Molekulargewicht

    m/z 182

    Skyline

    wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139

    Auffällige Isotopenmuster

    bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

    Summenformel

    C9 H7 Cl O2 6 DBE - C10H11ClO - 5 DBE - C11H15Cl 4 DBE

    Schlüsselion

    m/z 77

    Phenylring

    CO oder C2H4

    mögliche Partialstruktur

    C3H7 oder C2H3O


    Massenspektrometrie – eine Einführung normiert.

    139

    100

    50

    111

    182

    31

    43

    77

    50

    69

    85

    125

    147

    165

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    140

    160

    180

    200

    Beispiel 6

    EI-Spektrum

    m/z

    bei diesen Strukturen erwartet man einen [M-CH3]+ Peak bei m/z 167

    einige Strukturmöglichkeiten (Substitutionsmuster am Aromaten unberücksichtigt)


    Radikalkationen normiert.

    +•

    Ins Vakuum einschleusen

    Verdampfen

    Ionisieren

    +

    Laserbeschuss

    Matrixpräparation

    Kationen

    +

    Ins Vakuum einschleusen

    +

    +

    Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum

    EI

    MALDI


    + normiert.

    Target mit 16x24 = 384 Probenpositionen

    LDI und MALDI

    Man kann Verbindungen durch einen intensiven Laserpuls verdampfen und ionisieren.

    Diese Laser-Desorption-Ionisation mit einem N2Laser erfordert eine Bestrahlungsstärke von ca. 5MW/cm2 .

    Empfindliche, polare und grosse Moleküle werden bestenfalls als Fragmente detektiert.

    Um Fragmentierungen zu verhindern, wird die Probe mit einem grossen Überschuss einer Matrixsubstanz gemischt und auf der Probenfläche cokristallisiert. Dieses Gemisch liefert bereits bei 0.5 MW/cm2Bestrahlungsstärke intakte Ionen. Es wird als Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisation bezeichenet

    Die universellste Matrix ist 2,5-Dihydroxybenzoesäure, sie wurde von F. Hillenkamp und M. Karas eingeführt.


    + normiert.

    MALDI

    • Bei der MALDI werden im Gegensatz zur Elektronenstoßionisation keineRadikalkationen erzeugt, sondern es entstehen meist* Ionen mit gerader Elektronenzahl.

    positiv

    negativ

    • Weil der gefundene m/z Wert nicht gleich dem Molekulargewicht ist, sprichtman von Pseudomolekularionen.

    • Die Überschußenergie ist wesentlich geringer, s.d. man überwiegend intakte Pseudomolekularionen beobachtet.

    • Die Ionisation ist hervorragend für große Moleküle geeignet (Peptide, ProteineDNA, RNA Fragmente, Oligomere)

    *Bei Matrices mit Elektronenübertragung (z.B. DCTB) enstehen Radikalkationen oder/und Radikalanionen.


    + normiert.

    MALDI

    Spektrum einer basischen Verbindung C30H43NO2 MW 449.3

    Als Matrix wurde 2,5-Dihyroxybenzoesäure verwendet. Unter günstigen Umständen (wie diesen)sieht man nur den Pseudomolekularpeak der Probe.


    Intensität normiert.

    Intensität

    t

    t

    Flugzeitmassenspektrometer – „time of flight“ TOF

    Idealer Analysator bei pulsweiser Ionenproduktion wie sie bei MALDI und LDI vorliegt

    Laserimpuls

    Flugrohr (Länge l)

    Detektor

    Gitter auf 0V

    Probe aufHochspannung (U) ca. 20kV

    e U = ½ m v2

    sqrt(2eU/m) = v = s/t

    e = ElementarladungU = Beschleunigungsspannung

    m = Masse eines Molekülss = Länge des Flugrohrs

    t = Flugzeit


    + normiert.

    MALDI

    Spektrum eines Oligomeres – Ionenbildung durch Na+ Anlagerungen

    Abstand 44 Da

    Matrixionen

    Masse der repetierenden Einheit 44Da

    Vorschlag

    481.2 - 10* 44.03 - 23 = 18

    Masse der Endgruppen = 18Da

    Polyethylenglycol


    Radikalkationen normiert.

    +•

    Ins Vakuum einschleusen

    Verdampfen

    Ionisieren

    +

    Laserbeschuss

    Matrixpräparation

    Kationen

    +

    Ins Vakuum einschleusen

    +

    +

    Kationen

    Probe gelöst, Ionenbildung!

    Versprühen im E-Feld

    +

    Transfer zum Vakuum

    +

    +

    +

    +

    +

    Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum

    EI

    MALDI

    ESI


    [ normiert.M+H]+

    [M+2H]2+

    [M+NH4]+

    [M+2Na]2+

    [M+Na]+

    [M+K]+

    [2M+H]+

    [2M+NH4]+

    Negativmodus

    [M-H]-

    Bildung von Dimeren etc wie im Positivmodus

    [M+Cl]-

    [M+HCOO]-

    Welche Pseudomolekularionen können bei ESI beobachtet werden?

    Positivmodus

    Bei Gemischen auch Heterodimere

    Bei sehr leicht oxidablen Verbindungen[M-e]+

    [M+H+Na]2+

    usw.


    1cm normiert.

    Sehr feine Spitze

    Kontaktierung (0.6-2kV) Kapillare mit 10ul Probenlösung

    ES(I)

    Nanosprayeinlass

    Geöffnete Sprühkammer

    Ioneneintritt zum MS

    N2 Strom zur Desolvatation

    ESI aus einer Stahl-kapillare (Schleifeneinlass,HPLC)


    HPLC-MS Kopplung normiert.

    HPLC-Pumpe

    Injektionsventil

    ESI-MS

    Autosampler

    Trennsäule


    + normiert.

    +

    ES(I) – Electrosprayionisation

    (M+H)+

    2-Amino-3-methylbutanol

    K+

    Auch bei sehr empfindlichen Verbindungen keine Fragmentierung

    zum Vergleich das EI-Spektrum

    kein Molekülpeak sichtbar

    dafür Strukturinformation durchdie Fragmentierung!


    Isotopenpeaks beachten normiert.

    C2 H6 O Si

    Um welches Polymer könnte es sich handeln?

    Die beobachteten Ionen sind NH4+-Anlagerungen.

    Abstand betrachten 74.0188


    13+ normiert.

    14+

    12+

    15+

    11+

    8+

    7+

    10+

    9+

    Grosse Moleküle unter ESI-Bedingungen Beispiel Cytochrom C

    Δm/z = 1/15 = 0.0666


    Normal(scan)betrieb eines „Triplequads“ normiert.

    Ionenquelle

    Quadrupol 1

    Stosskammer

    Quadrupol 2

    Detektor

    Tochterionenmodus

    Ionenquelle

    Quadrupol 1

    Stosskammer

    Quadrupol 2

    Detektor

    Fragmentierung

    Nur ein m/z

    MS-MS Experiment –Daughter ions


    Gegenüberstellung EI normiert. ESI

    EI

    ESI


    Musteranalyse 1 normiert.

    Flüssigkeit leicht löslich in Methanol

    ESI

    Zugabe von NH4OAc

    MW 162

    Gerade Zahl von N

    Nicht basisch


    Musteranalyse 1 normiert.

    Mögliche Summenformeln für m/z 163bei einer Genauigkeit von +- 0.3 DaNur C,H,O zugelassen.

    Tochterionenspektrum von m/z 180

    -46

    -44

    180-NH3

    Anwesenheit von Heteroatmen


    Musteranalyse 1 normiert.

    Messung der exakten Massen

    Damit ist die Summenformel der neutralenVerbindung als C8H18O3 bestimmt

    Sie enthält keine Doppelbindungen oder Ringe

    Im Tochterionenspektrum war kein H2OVerlust sichtbar. Vermutlich handelt es sichum einen Ether.


    Musteranalyse 1 normiert.

    Tochterionenspektrum mit exakter Massenbestimmung

    -C2H6O = Ethanol

    -C2H4O

    symmetrisch?


    Musteranalyse 1 normiert.

    GC-MS-EI


    Musteranalyse 1 normiert.

    EI Spektrum z.B. mit GC Einlass

    Spektrensuche in der NIST-Datenbank (200000 Spektren)

    Vergleichsdarstellung mit dem besten Treffer

    MW 162


    Musteranalyse 2 normiert.

    Wasser/Methanol-lösliche Substanz

    • enthält eine aromatische Carbonsäure (als Ester)

    • enthält einen (?) Zuckerrest

    • enthält Quercetin (en Flavonoid)

    trägt am Ring Substituenten

    Methode ESI oder HPLC-ESI-MS

    C6H12O6 oder C5H10O5

    C28 H25 O16 DBE 16.5 Abweichung -0.101mDa


    Musteranalyse 2 normiert.

    MS-MS (Tochterionen) HCD

    trägt am Ring Substituenten

    C6H12O6 oder C5H10O5

    Die Gallussäure und der Zucker müssen miteinander verbunden sein


    2 Alterantiven normiert.

    Musteranalyse 2

    MS-MS (Tochterionen) CID

    Das Quercetin und der Zucker müssen miteinander verbunden sein.

    Es gibt kein Ion in dem Quercetin zusammen mit dem Galloylrest vorkommt



    What‘s new in the MS-group? normiert.

    LTQ-Orbitrap XL (ETD)


    Complete Scheme normiert.

    Demo Orbitrap


    Ltq orbitrap hybrid mass spectrometer
    LTQ Orbitrap™ Hybrid Mass Spectrometer normiert.

    Finnigan LTQ™ Linear Ion Trap

    API Ion source Linear Ion Trap C-Trap

    Orbitrap

    Differential pumping

    Differential pumping

    Inventor: Dr. Alexander Makarov, Thermo Electron (Bremen)

    Die Folien zur Orbitrap stammen aus einer Demonstration der Fa. Thermo Fisher Scientific


    Ltq orbitrap operation principle
    LTQ Orbitrap Operation Principle normiert.

    1. Ions are stored in the Linear Trap

    2. …. are axially ejected

    3. …. and trapped in the C-trap

    4. …. they are squeezed into a small cloud and injected into the Orbitrap

    5. …. where they are electrostatically trapped, while rotating around the central electrode

    and performing axial oscillation

    The oscillating ions induce an image current into the two outer halves of the orbitrap, which can be detected using a differential amplifier

    Ions of only one mass generate a sine wave signal


    Frequencies and masses

    The axial oscillation frequency follows the formula normiert.

    Where w = oscillation frequency

    k = instrumental constant

    m/z = …. well, we have seen this before

    Frequencies and Masses

    Many ions in the Orbitrap generate a complex signal whose frequencies are determined using a Fourier Transformation


    The orbitrap
    The Orbitrap normiert.


    Trajectories in the orbitrap
    Trajectories in the orbitrap normiert.

    • Characteristic frequencies:

      • Frequency of rotation ωφ

      • Frequency of radial oscillations ωr

      • Frequency of axial oscillations ωz

        r

    z

    φ


    Effect of resolution: example North Sea Oil „Gull Faks“ Nanospray positive

    Resolutions:

    unit res.

    7500

    30000

    100000


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