slide1
Download
Skip this Video
Download Presentation
Massenspektrometrie – eine Einführung

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 64

Massenspektrometrie – eine Einführung - PowerPoint PPT Presentation


  • 115 Views
  • Uploaded on

Massenspektrometrie – eine Einführung. H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie. Wozu dient die Massenspektrometrie?. Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen. In einem Bereich von 1Da..>100kDa. Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about ' Massenspektrometrie – eine Einführung' - aelan


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Massenspektrometrie – eine Einführung

H. Luftmann Abt. Massenspektrometrie

slide2

Wozu dient die Massenspektrometrie?

Mir ihrer Hilfe kann man die Masse von Atomen und Molekülen bestimmen.

In einem Bereich von 1Da..>100kDa

Mit einer Massengenauigkeit von bis zu 1ppm

Von Probenmengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g

Über Fragmentierungen erhält man Strukturhinweise

Mir ihrer Hilfe kann man die Menge von Verbindungen bestimmen.

Durch die Massenselektivität gelingt das auch in Gegenwart vonBeimengungen (mit anderer Masse).

Von Mengen im Bereich < 10-6 .. 10-15g

slide3

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Was sind die Voraussetzungen für eine MS-Messung?

  • Die Moleküle müssen vereinzelt, d.h. von ihresgleichen und von allen anderen abgetrennt werden. Wechselwirkungen würden die Massenbestimmung stören.
  • Die Moleküle müssen ionisiert werden. Die Ladung dient als „Griff“ um Kräfte auf das Molekül auszuüben.
slide4

MS

GC

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Verdampfen der Probe ins Hochvakuum – Direkteinlass, Tiegeleinlass,direct inlet, „Schubstange“

Kopplung eines Gaschromatographen mit einem Massenspektrometer – GC-MS

slide5

Radikalkationen

+•

Ins Vakuum einschleusen

Verdampfen

Ionisieren

+

Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum

EI

slide6

0V

positive Spannung fürpositive Ionen

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Elektronenionisation* - EI

10-5..10-7mBar

Turbomolekularpumpe

* Die veraltete Bezeichnung ist Elektronenstossionisation

slide7

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Elektronenionisation* - EI

  • Bei der (EI) wird die Substanz im Hochvakuum mit 70eV Elektronen beschossen. Der größte Teil der Energie wird nicht auf das Molekül übertragen. Lediglich 6-10eV dienen zur Ionisation nach dem Schema:
      • M + e- M+. + 2e-
  • Darüber hinaus werden noch 2-10eV Energie (sog. Überschußenergie) auf das Molekül übertragen. Das führt zur Anregung des Moleküls und zur Fragmentierung.

Ein EI-Spektrum ist die Auftragung derHäufigkeit der im Zeitraum von 10-8 sgebildeten Ionen gegen ihren m/z Wert(bei z=1 entspricht das der Masse).

slide8

Detektor

Ionenbahnen

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Quadrupolanalysator (Quadrupolmassenfilter)

Quadrupolstäbe

Wechselspannung

m/z zu klein

Ioneneintritt

m/z passend

m/z zu gross

slide9

Substanzeinlass

Ionenquelle

Analysator

Detektor

Sekundärelektronenvervielfacher SEV, secondary electron multiplier SEM

Elektronen

Ionen

V 100V

Hoher Verstärkungsfaktor >106geringes Eigenrauschen, schnell.

slide10

Die Peakhöhe wird auf den intensivsten Peak (100%) normiert.

Die Peaks haben eine Breite, die von der instrumentellen Massenauflösung abhängt.

Die x-Achse ist eine m/z Skala!

Oft werden die Rohdaten in ein Strichspektrumumgerechnet. Hier kann es zu Rundungs-problemen kommen

Das erste Ergebnis jeder Messung ist ein „Rohspektrum“

Die angezeigten Massenwerte stellen die Schwerpunkte oder die Maximalwerte der Rohdatenpeaks dar.

slide11

Isotopie und Atomgewichte alle Angaben in Dalton (Da)

12C 98,9%

35Cl 75,7%

79Br 50,7%

81Br 49,3%

1H 99.998%

37Cl 24,3%

13C 1,1%

2H 0.015%

Kohlenstoff

Chlor

Brom

Wasserstoff

Das stöchiometrische Atomgewicht (average mass) ist das gewichtete Mittel der Isotopeneinzelgewichte

12,011 35,46 79,9 1,0079

Auch die Massen der reinen Isotope sind nicht ganzzahlig (Ausnahme 12C)

12,0000034,968378,917791,007813,00281 2,0141 36,96535 80,91574

slide12

72

76

155

157

192

190

194

73

77

158

C6

C6H4

C6H4Br

C6H4BrCl

Molekülionen sind meist eine Gruppe von Peaks, sie entsteht durch die Kombination der natürlichen Isotopen der beteiligten Elemente.

Schrittweiser Aufbau des Isotopenclusters von C6H4BrCl

slide13

Molekulargewichtsdefinitionen (nach IUPAC)

Das stöchiometrisches Molekulargewicht (average mass) ist die Summe der Atomgewichte. Darin sind die mit ihrer Häufigkeit gewichteten Isotope in ihrer natürlichen Verteilung enthalten.

Das nominale Molekulargewicht ist die Summe der gerundeten Isotopenmassen (der häufigsten Isotope).

Das „monoisotopische Ion“ ist die Kombination der häufigsten Isotope. Es ist nicht notwendigerweiseder intensivste Peak eines Isotopenclusters.

Eine Massenangabe wird als „exakte Masse“ bezeichnet, wenn sie mit einer Präzision von +-5ppm(oder +-5mDa) bestimmt oder berechnet wurde.

Beispiel C6H4BrCl

average 191.459

nominal 190

nominal 192

exakte Massen 191.91499 12C61H437Cl79Br 191.9159012C61H435Cl81Br

monoistopisch 189.9179

bei nicht ausreichender Auflösung wird der Summenpeak mit m/z 191.9156 gefunden

slide14

Unregistered

100

90

80

70

C19H36O C20H40

60

m/z

280.31300281.31645282.31993

m/z280.27661281.28003282.28319

50

40

Unregistered

100

30

90

20

80

10

70

0

280

281

282

283

284

60

50

40

30

20

10

0

280

281

282

283

284

Hochauflösung

Befinden sich auf der gleichen Nominalmasse zwei oder mehr Ionen verschiedenerElementarzusammensetzung, so muß die Auflösung des Massenspektrometers besonderserhöht werden, um diese unabhängig voneinander bestimmen zu können.

Bei Werten von R10%Tal > 10.000 spricht man von Hochauflösung.

Massenunterschied 0,037Da

notwendige Auflösung 280/0,037= 7500

slide15

.CH3

CO

C2H4

HCl

EI-Spektrum - Interpretationsansatz

CH3CO+

C3H7+

Skyline

wohldefinierte Bruchstellen

Molekülion

m/z 154/155/156/157

Isotopenmuster

enthält 1 Chloratom

Fragmentierungen

M-15, M-15-28, M-15-28-36

charakteristische Ionen

m/z 38/39; 50..52; 62..65; 74..78

Alle EI-Beispielspektren sind der NIST Datensammlung entnommen

slide16

Bildung stabiler Kationen

Abspaltung günstiger (=stabiler) Radikale

Abspaltung stabiler (kleiner) Neutralteilchen

Was bestimmt den Zerfall von angeregten Radikalkationen?

slide17

Beispiel 1

m/z 101

α-Spaltung

m/z 86

m/z 58

m/z 30

slide18

Stickstoffsregel

Ist das Molekülion geradzahlig, so enthält das Molekül eine gerade Anzahl von N-Atomen (oder keine).

Ist das Molekülion ungeradzahlig enthält es eine ungerade Zahl von N-Atomen

Doppelbindungsregel

nC, nH, nN = Anzahl der Atome

Die Zahl der Doppelbindungen und/oder Ringe lässt sich folgendermassen berechnen:

Wenn Stickstoff anwesend ist, muss das berücksichtigt werden:

slide19

Beispiel 2

m/z 142

m/z 71

m/z 57

Keine Abspaltungen von CH2 sondern vonEthen, Propen, Buten usw.

m/z 29

slide20

Beispiel 3

m/z 134

m/z 91

McLafferty Umlagerung

m/z 92

slide21

Beispiel 4

McLafferty Umlagerung:

das ML-Ion beinhaltet die Alkoholseite und die Position 2 des Esters.

Substitution an diesen Positionen verschiebt das Produktion.

m/z 74

slide22

Beispiel 5

Diese Verbindung enthält nur 1 Heteroatom.

slide23

Massenspektrometrie – eine Einführung

139

100

50

111

182

31

43

77

50

69

85

125

147

165

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Beispiel 6

EI-Spektrum

m/z

Molekulargewicht

m/z 182

Skyline

wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139

Auffällige Isotopenmuster

bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

slide24

Massenspektrometrie – eine Einführung

139

100

50

111

182

31

43

77

50

69

85

125

147

165

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Beispiel 6

DBE = ((2*Zahl der C-Atome + 2)-Zahl der H-Atome)/2

Cl zählt als einbindiges Atom wie ein H.

EI-Spektrum

m/z

Molekulargewicht

m/z 182

Skyline

wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139

Auffällige Isotopenmuster

bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

Summenformel

C8H19ClO2

C9 H7 Cl O2

C10H11ClO

C11H15Cl

„übersättigt“ maximal wäre H17

6 Doppelbindungsäquivalente

5 Doppelbindungsäquivalente

4 Doppelbindungsäquivalente

slide25

Massenspektrometrie – eine Einführung

139

100

50

111

182

31

43

77

50

69

85

125

147

165

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Beispiel 6

EI-Spektrum

m/z

Molekulargewicht

m/z 182

Skyline

wenige Fragmente, stabiles Ion bei m/z 139

Auffällige Isotopenmuster

bei m/z 111, 139, 182  ein Chlor enthalten.

Summenformel

C9 H7 Cl O2 6 DBE - C10H11ClO - 5 DBE - C11H15Cl 4 DBE

Schlüsselion

m/z 77

Phenylring

CO oder C2H4

mögliche Partialstruktur

C3H7 oder C2H3O

slide26

Massenspektrometrie – eine Einführung

139

100

50

111

182

31

43

77

50

69

85

125

147

165

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Beispiel 6

EI-Spektrum

m/z

bei diesen Strukturen erwartet man einen [M-CH3]+ Peak bei m/z 167

einige Strukturmöglichkeiten (Substitutionsmuster am Aromaten unberücksichtigt)

slide27

Radikalkationen

+•

Ins Vakuum einschleusen

Verdampfen

Ionisieren

+

Laserbeschuss

Matrixpräparation

Kationen

+

Ins Vakuum einschleusen

+

+

Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum

EI

MALDI

slide28

+

Target mit 16x24 = 384 Probenpositionen

LDI und MALDI

Man kann Verbindungen durch einen intensiven Laserpuls verdampfen und ionisieren.

Diese Laser-Desorption-Ionisation mit einem N2Laser erfordert eine Bestrahlungsstärke von ca. 5MW/cm2 .

Empfindliche, polare und grosse Moleküle werden bestenfalls als Fragmente detektiert.

Um Fragmentierungen zu verhindern, wird die Probe mit einem grossen Überschuss einer Matrixsubstanz gemischt und auf der Probenfläche cokristallisiert. Dieses Gemisch liefert bereits bei 0.5 MW/cm2Bestrahlungsstärke intakte Ionen. Es wird als Matrix-Assistierte Laser-Desorption-Ionisation bezeichenet

Die universellste Matrix ist 2,5-Dihydroxybenzoesäure, sie wurde von F. Hillenkamp und M. Karas eingeführt.

slide29

+

MALDI

  • Bei der MALDI werden im Gegensatz zur Elektronenstoßionisation keineRadikalkationen erzeugt, sondern es entstehen meist* Ionen mit gerader Elektronenzahl.

positiv

negativ

  • Weil der gefundene m/z Wert nicht gleich dem Molekulargewicht ist, sprichtman von Pseudomolekularionen.
  • Die Überschußenergie ist wesentlich geringer, s.d. man überwiegend intakte Pseudomolekularionen beobachtet.
  • Die Ionisation ist hervorragend für große Moleküle geeignet (Peptide, ProteineDNA, RNA Fragmente, Oligomere)

*Bei Matrices mit Elektronenübertragung (z.B. DCTB) enstehen Radikalkationen oder/und Radikalanionen.

slide30

+

MALDI

Spektrum einer basischen Verbindung C30H43NO2 MW 449.3

Als Matrix wurde 2,5-Dihyroxybenzoesäure verwendet. Unter günstigen Umständen (wie diesen)sieht man nur den Pseudomolekularpeak der Probe.

slide31

Intensität

Intensität

t

t

Flugzeitmassenspektrometer – „time of flight“ TOF

Idealer Analysator bei pulsweiser Ionenproduktion wie sie bei MALDI und LDI vorliegt

Laserimpuls

Flugrohr (Länge l)

Detektor

Gitter auf 0V

Probe aufHochspannung (U) ca. 20kV

e U = ½ m v2

sqrt(2eU/m) = v = s/t

e = ElementarladungU = Beschleunigungsspannung

m = Masse eines Molekülss = Länge des Flugrohrs

t = Flugzeit

slide32

+

MALDI

Spektrum eines Oligomeres – Ionenbildung durch Na+ Anlagerungen

Abstand 44 Da

Matrixionen

Masse der repetierenden Einheit 44Da

Vorschlag

481.2 - 10* 44.03 - 23 = 18

Masse der Endgruppen = 18Da

Polyethylenglycol

slide33

Radikalkationen

+•

Ins Vakuum einschleusen

Verdampfen

Ionisieren

+

Laserbeschuss

Matrixpräparation

Kationen

+

Ins Vakuum einschleusen

+

+

Kationen

Probe gelöst, Ionenbildung!

Versprühen im E-Feld

+

Transfer zum Vakuum

+

+

+

+

+

Vom neutralen Molekül zum Ion im Hochvakuum

EI

MALDI

ESI

slide35

[M+H]+

[M+2H]2+

[M+NH4]+

[M+2Na]2+

[M+Na]+

[M+K]+

[2M+H]+

[2M+NH4]+

Negativmodus

[M-H]-

Bildung von Dimeren etc wie im Positivmodus

[M+Cl]-

[M+HCOO]-

Welche Pseudomolekularionen können bei ESI beobachtet werden?

Positivmodus

Bei Gemischen auch Heterodimere

Bei sehr leicht oxidablen Verbindungen[M-e]+

[M+H+Na]2+

usw.

slide36

1cm

Sehr feine Spitze

Kontaktierung (0.6-2kV) Kapillare mit 10ul Probenlösung

ES(I)

Nanosprayeinlass

Geöffnete Sprühkammer

Ioneneintritt zum MS

N2 Strom zur Desolvatation

ESI aus einer Stahl-kapillare (Schleifeneinlass,HPLC)

slide37

HPLC-MS Kopplung

HPLC-Pumpe

Injektionsventil

ESI-MS

Autosampler

Trennsäule

slide38

+

+

ES(I) – Electrosprayionisation

(M+H)+

2-Amino-3-methylbutanol

K+

Auch bei sehr empfindlichen Verbindungen keine Fragmentierung

zum Vergleich das EI-Spektrum

kein Molekülpeak sichtbar

dafür Strukturinformation durchdie Fragmentierung!

slide39

Isotopenpeaks beachten

C2 H6 O Si

Um welches Polymer könnte es sich handeln?

Die beobachteten Ionen sind NH4+-Anlagerungen.

Abstand betrachten 74.0188

slide40

13+

14+

12+

15+

11+

8+

7+

10+

9+

Grosse Moleküle unter ESI-Bedingungen Beispiel Cytochrom C

Δm/z = 1/15 = 0.0666

slide41

Normal(scan)betrieb eines „Triplequads“

Ionenquelle

Quadrupol 1

Stosskammer

Quadrupol 2

Detektor

Tochterionenmodus

Ionenquelle

Quadrupol 1

Stosskammer

Quadrupol 2

Detektor

Fragmentierung

Nur ein m/z

MS-MS Experiment –Daughter ions

slide43

Musteranalyse 1

Flüssigkeit leicht löslich in Methanol

ESI

Zugabe von NH4OAc

MW 162

Gerade Zahl von N

Nicht basisch

slide44

Musteranalyse 1

Mögliche Summenformeln für m/z 163bei einer Genauigkeit von +- 0.3 DaNur C,H,O zugelassen.

Tochterionenspektrum von m/z 180

-46

-44

180-NH3

Anwesenheit von Heteroatmen

slide45

Musteranalyse 1

Messung der exakten Massen

Damit ist die Summenformel der neutralenVerbindung als C8H18O3 bestimmt

Sie enthält keine Doppelbindungen oder Ringe

Im Tochterionenspektrum war kein H2OVerlust sichtbar. Vermutlich handelt es sichum einen Ether.

slide46

Musteranalyse 1

Tochterionenspektrum mit exakter Massenbestimmung

-C2H6O = Ethanol

-C2H4O

symmetrisch?

slide48

Musteranalyse 1

EI Spektrum z.B. mit GC Einlass

Spektrensuche in der NIST-Datenbank (200000 Spektren)

Vergleichsdarstellung mit dem besten Treffer

MW 162

slide49

Musteranalyse 2

Wasser/Methanol-lösliche Substanz

  • enthält eine aromatische Carbonsäure (als Ester)
  • enthält einen (?) Zuckerrest
  • enthält Quercetin (en Flavonoid)

trägt am Ring Substituenten

Methode ESI oder HPLC-ESI-MS

C6H12O6 oder C5H10O5

C28 H25 O16 DBE 16.5 Abweichung -0.101mDa

slide50

Musteranalyse 2

MS-MS (Tochterionen) HCD

trägt am Ring Substituenten

C6H12O6 oder C5H10O5

Die Gallussäure und der Zucker müssen miteinander verbunden sein

slide51

2 Alterantiven

Musteranalyse 2

MS-MS (Tochterionen) CID

Das Quercetin und der Zucker müssen miteinander verbunden sein.

Es gibt kein Ion in dem Quercetin zusammen mit dem Galloylrest vorkommt

slide53

What‘s new in the MS-group?

LTQ-Orbitrap XL (ETD)

slide54

Complete Scheme

Demo Orbitrap

ltq orbitrap hybrid mass spectrometer
LTQ Orbitrap™ Hybrid Mass Spectrometer

Finnigan LTQ™ Linear Ion Trap

API Ion source Linear Ion Trap C-Trap

Orbitrap

Differential pumping

Differential pumping

Inventor: Dr. Alexander Makarov, Thermo Electron (Bremen)

Die Folien zur Orbitrap stammen aus einer Demonstration der Fa. Thermo Fisher Scientific

ltq orbitrap operation principle
LTQ Orbitrap Operation Principle

1. Ions are stored in the Linear Trap

2. …. are axially ejected

3. …. and trapped in the C-trap

4. …. they are squeezed into a small cloud and injected into the Orbitrap

5. …. where they are electrostatically trapped, while rotating around the central electrode

and performing axial oscillation

The oscillating ions induce an image current into the two outer halves of the orbitrap, which can be detected using a differential amplifier

Ions of only one mass generate a sine wave signal

frequencies and masses

The axial oscillation frequency follows the formula

Where w = oscillation frequency

k = instrumental constant

m/z = …. well, we have seen this before

Frequencies and Masses

Many ions in the Orbitrap generate a complex signal whose frequencies are determined using a Fourier Transformation

trajectories in the orbitrap
Trajectories in the orbitrap
  • Characteristic frequencies:
    • Frequency of rotation ωφ
    • Frequency of radial oscillations ωr
    • Frequency of axial oscillations ωz

r

z

φ

slide60

Effect of resolution: example North Sea Oil „Gull Faks“ Nanospray positive

Resolutions:

unit res.

7500

30000

100000

ad