Genoma umano e malattie genetiche
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Genoma Umano e malattie genetiche. lezione 5-6 Martedì 12 Aprile. cluster Ig topo-uomo. mta1. crip2. crip1. hole. a. e. g2 a. g2 b. g1. g3. d. m. J. D. V. Mouse Igh cluster Chromosome 12. Em. hs 1,2. hs 3A. mta1. trascrizione. hs 4. hs 3B. JDV. 12F1.

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Genoma Umano e malattie genetiche

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Genoma umano e malattie genetiche

Genoma Umano e malattie genetiche

lezione 5-6 Martedì 12 Aprile


Cluster ig topo uomo

cluster Ig topo-uomo

mta1

crip2

crip1

hole

a

e

g2a

g2b

g1

g3

d

m

J

D

V

Mouse Igh cluster Chromosome 12

Em

hs 1,2

hs 3A

mta1

trascrizione

hs 4

hs 3B

JDV

12F1

BAC199M11(AF450245)

mta1

crip2

crip1

hole

a2

e

g4

g2

g

a1

e

g1

g3

d

m

J

D

V

Human Igh cluster Chromosome 14

Em

hs 1,2

hs 3

hs 1,2

hs 3

mta1

hs 4

hs 4

JDV

14q32.33

3’a2

3’a1

g

hs4

hs1.2

hs3

20bp

a1

elk 2.1

3’a1

86,035,000

86,040,000

86,045,000

86,050,000

86,055,000

86,060,000

86,065,000

86,070,000

86,075,000

hole

elk 2.2

hs4

hs1.2

hs3

a2

20bp

3’a2

85,894,500

85,904,500

85,914,500

85,924,500

85,934,500

85,944,500

85,954,500

centromero

telomero

(rischio riarrangiamenti)

IgH3’RR-A

IgH3’RR-B


Le regioni regolative delle ig

le regioni regolative delle Ig

geni della regione costante al 3’ delle regioni variabili *

trascrizione

regione duplicata

regione duplicata

reg. variab.*

a2

4

2

1



1

3

V D J *



centromero

3 enhancers

3 enhancers

enhancer 5’

IgH3’RR-B

IgH3’RR-A

Chromosome 14q32


Quante funzioni per la maturazione delle ig

quante funzioni per la maturazione delle Ig ?

metodo riduzionistico

metodo olistico globale

che approccio possiamo usare nel topo

e

quale nell’uomo ?


Metodo riduzionista

metodo riduzionista

la genomica permette studi globali

ma come si possono studiare le regioni cis regolative ?

si possono ottenere topi transgenici, ma uomini no

si possono ottenere linee cellulari transgeniche anche umane

il knock - out ed il knock - in sono molto usati


Mutanti umani a disposizione

mutanti umani a disposizione ?

quali sono le mutazioni umane che si possono studiare ?

a = polimorfismi

b = patologie


Modello della regolazione delle ig

modello della regolazione delle Ig

non ci sono due genomi uguali

(a parte i gemelli omozigoti)

infatti si trovano polimorfismi dovunque si cercano

prima della conoscenza di tutto il genoma erano più rari perchè si cercavano solo sulle sequenze codificanti

la nuova frontiera sta nelle sequenze regolative


Epigenetica

epigenetica

nella oligarchia regolativa

la gerarchia ha le sue eccezioni

il sistema è bidirezionale e deve tener conto dell’ambiente

i semi sono programmati ma senza interazione con l’ambiente non possono germinare

esempio troppo banale


Altro esempio

altro esempio

il sistema immunitario ha una sua programmazione ma il suo compito è deve proteggere dalle infezioni e

deve essere reattivo all’ambiente

quindi si tratta di gerarchia intelligente : modulabile


Modello jacob monod

modello Jacob-Monod

fino da questo modello dellla regolazione del primo operone era chiara la necessità di interazione con l’ambiente

per ambiente non si intende solo lo spazio esterno all’organismo ma anche intercellulare o citoplasmatico

la cascata della regolazione ha a che fare con le modificazioni epigenetiche

non è sempre chiaro chi regola chi


Lcr locus control region nel topo 4 enhancers igh3 rr 1 2 nell uomo 3 enhancers locus

LCR locus control region (nel topo 4 enhancers)IgH3’RR-1/-2 (nell’uomo 3 enhancers/locus)

LCR

*HS = hyper sensitivity to DNase I

*HS3A HS1,2 HS3B HS4

mouse Ig heavy locus

V D J

a





b

L C R

human

chromosome

14 q 32

HS3B HS1,2B HS4B

HS3A HS1,2A HS4A

3’RR-A

3’RR-B

3

1



1

2

4

a2



centromero

duplicazione 1

duplicazione 2


L contigs delle regioni igh 3 rr

contigs del sequenziamento genoma umano e precedenti

Y14407

AL928765

U64453

X76785

AL928767

CHR77

(35.616 kb)

Chromosome 14

IgH3’RR-A

elk

elk

4

2

1



1

2

3



centromero

SF AL928742 (40 kb)

IgH3’RR-B

l contigs delle regioni IgH 3’RR


Igh3 rr a

IgH3’RR-A

SA2.5

A2R

Poly A

site

END OF HOMOLOGY WITH ALFA2

H*

H

B

E

B

B

B

H

B

H

H

U

14

U9

1

R4

R6

Ua1

U3

U5

R3

R3r

U5r

Ua4

R5

Alu

LTR

ELK2

U1

R1

R2

U4

U6

U7

U8

U6r

Ua2

Ua3

R5

U11

U12

U16

U13

K10 retrovirus

U15

Ua5

U10

U2

A

HS3

HS1,2

HS4

Y14407

AL928765

U64453

X76785

AL928767

CHR77

(35.616 kb)

Chromosome 14

4

2

1



1

2

3

centromero



IgH3’RR-B

B

SF AL928742 (40 kb)

Poly A

site

END OF HOMOLOGY WITH ALFA1

H

H

B

B

H

B

E

B

B

H

U9

Ub4

R6

Alu

LTR

2

R1

U6r

R4

Ub3

R5

Ub1

Ub2

R3

U

8r

U5

U4-5

U

3

U13

U14

U15

U16

U2

U4

U7

U10

U11

U12

R3r

R5

U1

U7r

U5r

R3

U6

HS3

HS1,2

HS4

SA2.5

A2R

A2F


Synergism of hs3a b hs1 2 hs4

synergism of HS3A-B-HS1,2-HS4

TOR VERGATA

Symergic effects

HS fragments are able to synergize with Vk,VH,IgH germline promoters (g2b, g3, a,e) and non Ig-prmoters (c-myc) so as to enhance the transcription activity in a tissue and stage specific manner. (Ong et al, 1998)


Genoma umano e malattie genetiche

Polymorphism of the human a1 immunoglobulin gene 3’ enhancer HS1,2 and its relation to gene expression

Immunology 2001, 103: 35-40


Le due 3 rr sono ridondanti

le due 3’RR sono ridondanti

TOR VERGATA

se nell’uomo ci sono due 3’RR ci sarà un motivo ?

3 domande:

è cambiato il sistema di regolazione rispetto al topo ?

nell’uomo si possono studiare i polimorfismi (i topi di campagna si studiano male)

- dalle diverse forme alleliche si può capire il funzionamento delle due 3’RR ?

- hanno tempi di attivazione diversi?

- si attivano e disattivano nelle fasi diverse della vita

del linfocita B?


Come si possono studiare nell uomo le 3 rrs

come si possono studiare nell’uomo le 3’RRs

perchè nell’uomo? il modello murino è parziale: una sola 3’RR

in vitro

in epidemiologia genetica

in patologia


Studio di correlazione dei polimorfismi

Studio di correlazione dei polimorfismi

Che cosa possiamo andare a studiare nella struttura

La struttura regolatrice ha dei polimorfismi che coinvolgono la funzione in quanto variano i siti di legame dei fattori di trascrizione

Ad ogni forma allelica può corrispondere una diversa funzione

Studio della distribuzione degli alleli nelle diverse popolazioni

Esistono frequenze alleliche diverse nelle popolazioni umane


I polimorfismi

i polimorfismi

H*

H

B

B

E

E

B

B

B

B

H

4420 bp

Core of enhancer HS1,2

14bp

16bp

20bp

A

B

Selective amplification of HS1,2-A downstream Ca1 (IgH3’EC-1)

Selective amplification of HS1,2-B downstream Ca2 (IgH3’EC-2)

Poly A site

Poly A site

B

H

B

HS 3

HS 3

U8

r

U7r

R3

R3

R3r

Ub2

U5

U1

R1

Ub1

R3

R3 r

Ua1

U5

U8

U1

U3

2m

U2

U6

U4-5

U6r

U5r

R4

U4

U6

U7

1m

R1

R2

UU

3 4

HS 1,2

U2

HS 1,2

SA2.5

5402 bp

HS1,2

HS 3

HS1,2

A2R

SA2.5

A2R

A2F

EcoRI

HS1,2

ALLELE 1A

D3Rev

P3Frw

EcoRI

ALLELE 2A

EcoRI

EcoRI

HS1,2

ALLELE 3B

ALLELE 3A

P3Frw

EcoRI

EcoRI

D3Rev

ALLELE 4B

ALLELE 4A

Repeated element - 38 bp

Internal spacers

External element - 31 bp

External element -17 bp

Conserved sequence Unit


Gli alleli

gli alleli

A

M1

M2

G

A

B

G

A

B

G

A

B

CM11

CM 4

CM 5

400 bp

300 bp

200 bp

100 bp

38bp Rp

17bp El.

END HS1,2

17bp El.

B

72

ALLELE 1A

CORE enhancer

ALLELE 2

ALLELE 3

ALLELE 4

ALLELE 1

14bp Sp.

ALLELE 2A

114

16bp Sp.

178

ALLELE 3A

31bp El

20bp Sp.

ALLELE 3B

198

ALLELE 4A

250

Sites for : AP4; E47; MYOD; mE5

Sites for : CMYB

250

ALLELE 4B

Sites for :IK2; MZF1; NF-kB (P50)

Sites for :CEBP; CETS1P54 (-); CMYB; HSF; MEF2; OCT1; SR-Y; STAT; TH1E47; YY1 (-)

Sites for : NF-kB (Q6)


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