Trafic v siculaire intra cellulaire
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TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE PowerPoint PPT Presentation


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TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE. Moyens de communication de la cellule avec l'environnement. Procaryotes Tout passe par la membrane plasmique Eucaryotes Endocytose milieu extra cellulaire  lysosomes  digestion  métabolites dans le cytosol Exocytose : voie sécrétoire

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TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

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Presentation Transcript


TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE


Moyens de communication de la cellule avec l'environnement

  • Procaryotes

    • Tout passe par la membrane plasmique

  • Eucaryotes

    • Endocytose

      • milieu extra cellulaire  lysosomes  digestion  métabolites dans le cytosol

    • Exocytose : voie sécrétoire

      • synthèse de nouvelles molécules  compartiments  surface


Fig 13-1

  • Les voies endocytaire et sécrétoire

    • voie endocytaire

    • voie sécrétoire

    • voies de retour


La lumière

  • Espace compris à l'intérieur d'un compartiment limité par une membrane

  • Topologiquement toutes équivalentes entre elles et avec l'espace extra cellulaire


Rôle de la voie endo/exo-cytaire

  • Modification des molécules qui seront sécrétées vers l'extérieur

  • Connections (indirecte) de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique


Topologie des membranes

  • Les lumières sont équivalentes

  • Le transport se fait par vésicules


Le cargo

  • Molécule luminale ou membranaire qui est transportée par la vésicule


Fig 13-2

Transport vésiculaire

maintien de l'asymétrie de la membrane

pas de membrane à traverser pour les molécules solubles

Fusion des feuillets bleus

Fusion des feuillets rouges


Fig 13-3

Compartiments intracellulaires impliqués dans les voies endo/exo-cytaires

Recirculation

Voie endocytaire

Golgi  RE

Endos tardif  Golgi

Endos précoce  membrane

Voie sécrétrice


Équilibre entre les compartiments

  • Entrées = sorties

  • Pour les membranes et pour les cargos 

  • Un aller  un retour

  • Sélectivité

    • Des cargos transportés

    • Des destinations


TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA-CELLULAIRE

  • Les mécanismes moléculaires du transport par membrane et le maintien de la diversité des compartiments

  • Transport à partir du réticulum endoplasmique à travers le Golgi

  • Transport du TGN vers les lysosomes

  • Transport de la membrane plasmique vers l'intérieur de la cellule : endocytose

  • Transport du TGN vers l'extérieur de la cellule : exocytose


TRAFIC VÉSICULAIRE INTRA CELLULAIRE

I - Les mécanismes moléculaires du transport membranaire et le maintien de la diversité des compartiments

  • Phénomènes de bourgeonnement et fusion

  • Maintien des différences entre les compartiments


Problème

  • Échange permanent entre les compartiments  mélange des molécules  tous les compartiments finiront pas être identiques


La solution

  • Marqueurs moléculaires exprimés à la surface cytosolique des membranes


Méthodes d'approche

  • Systèmes sans cellules

  • Protéines de fusion avec la GFP

  • Génétique


Systèmes sans cellules

  • Population donneuse

    • cellules mutantes qui n'ont pas N-acétylglucosamine transférase I

    • infectées par un virus (donc glycoprotéine virale présente)

    • pas de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine

  • Golgi accepteur

    • possède N-acétylglucosamine transférase I (type sauvage)

    • non infecté par le virus donc pas de glycoprotéine virale

  • Mélange des deux

    • présence de glycoprotéine virale porteuse de N-acétylglucosamine 

  • Il a fallu qu'il y ait transport


Protéines de fusion avec la GFP


Génétique

  • Protéines thermosensibles codées par des mutants

  • Phénomène de suppression multicopies


Éléments d'approche

  • Les types de vésicules

  • Assemblage du manteau (les GTPases)

  • Guidage du transport (les SNARE)

  • Amarrage (protéines Rab)

  • Fusion


Éléments d'approche

  • Les types de vésicules

  • Assemblage du manteau (les GTPases)

  • Guidage du transport (les SNARE)

  • Amarrage (protéines Rab)

  • Fusion


1 - Les types de vésicules

  • Vésicules recouvertes sur leur face cytosolique

  • Bourgeonnement

  • Perte du manteau

  • Fusion des membranes


Les deux rôles du manteau

  • Concentration de protéines membranaires dans un patch qui formera la vésicule  permet la sélection des molécules à transporter

  • Moule la vésicule qui aura ainsi toujours à peu près la même taille


Les trois types de manteau des vésicules recouvertes

  • Clathrine

  • COPI

  • COPII


Fig 13-4

Les trois types de manteau des vésicules recouvertes


Utilisation des différents manteaux dans le trafic vésiculaire

Clathrine : à partir du Golgi et à partir de la membrane plasmique

au moins trois types de vésicules à clathrine

COPI et COPII : à partir du RE et du Golgi

Beaucoup d'autres


Fig 13-5

Utilisation des différents manteaux dans le traffic vésiculaire


Éléments d'approche

  • Les types de vésicules

  • Assemblage du manteau (les GTPases)

  • Guidage du transport (les SNARE)

  • Amarrage (protéines Rab)

  • Fusion


2 - Assemblage du manteau

a - Exemple : clathrine

Le plus étudié

(b - COPI et COPII)


Fig 13-6

Puits et vésicules recouverts de clathrine en congélation sublimation rapide


Clathrine

Une sous-unité de clathrine =

3 grosses chaînes +

3 petites chaînes

Une sous-unité = un triskélion

Assemblage des triskélions en un panier d'hexagones et pentagones

Triskélions peuvent s'assembler spontanément en panier même sans membrane


Fig 13-7

Manteau de clathrine

  • (B) Deux triskélions

    • chaînes lourdes en gris ou rouge

    • chaînes légères en jaune

(C) Cryo-électro-microphotographie

(A) Ombrage au platine


Manteau de clathrine

  • Un manteau = 36 triskélions (sans la vésicule)

  • 12 pentagones + 6 hexagones

  • Formation de deux coquilles

    • externe

    • interne : domaines N-terminaux des chaînes lourdes où se fixent les adaptines

  • Sur une vésicle : 12 pentagones + beaucoup plus d'hexagones


Adaptine

  • Protéine de manteau à clathrine

  • Complexe multiprotéique

  • Lie la clathrine à la membrane

  • Piège les protéines transmembranaires dont les récepteurs qui capturent les cargos solubles

  • Au moins 4 types d'adaptine pour les différents récepteurs de cargo


Fig 13-8

Assemblage et désassemblage d'un manteau de clathrine

Les adaptines se lient à la clathrine et au complexe cargo/cargo-r

Dynamine = GTPase


Pincement de la membrane

Dynamine + autres protéines

Fusion des feuillets non cytosoliques (grâce à la dynamine)


Fig 13-9

Rôle de la dynamine

Puits à clathrine dans les cellules nerveuses de drosophiles shibire ayant une mutation du gène de la dynamine entraînant une paralysie. Anneau correspondant à la dynamine mutée


Perte du manteau

  • La vésicule quitte la membrane

  • Le manteau de clathrine est perdu immédiatement

    • intervention de chaperonne de la famille des hsp70 (ATPase)

    • auxilline active l'ATPase

  • La vésicule doit attendre d'être constituée pour que le manteau se retire


Spécificité du manteau

  • Mécanismes généraux identiques

  • Mais chaque membrane a ses spécificités

    • membrane plasmique (riche en cholestérol) : nécessité de beaucoup d'énergie

    • autres membranes : existence de bourgeonnements


b - Protéines autres que la clathrine

  • CopI : 7 sous-unités protéiques

    analogies avec adaptine

    • Bourgeonnement à partir du Golgi

  • CopII : 4 sous-unités protéiques

    • Bourgeonnement à partir du RE

  • (a – Clathrine)


Toutes les vésicules ne sont pas sphériques

  • Membranes contenant des protéines fluorescentes

  • Long tubules qui émanent de endosomes et réseau trans-golgien (TGN)

  • Ces tubules peuvent servir de transporteurs (grand rapport surface / volume)

  • "une vésicule peut être tubulaire !"


c –Contrôle de l'assemblage du manteau : GTPases monomériques, rappel


c –Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel)

  • GTP binding proteins

    • 2 états

      • Actif avec liaison de GTP

      • Inactif avec liaison de GDP

    • 2 types

      • Monomérique (= GTPases monomériques) les mieux connues

      • Trimérique (= GTPases trimériques = protéines G)

  • Passage d'un état à l'autre par

    • GEFs (Guanine-nucleotide-Exchange Factors) GDP  GTP

    • GAPs (GTPase-Activating Proteins) GTP  GDP


Fig 13-10

Formation d'une vésicule à COPII (RE)

GTPase monomériquerecruteuse de manteau

Sar 1-GTP recrute COPII vers la membrane

= Sec12


GTP binding proteins (Rappel)

  • Monomérique

    • GTPases

      • GTPases de recrutement du manteau

        • Protéines ARF (ADP Ribosylation Factor)

          • Assemblage COPI et clathrine au Golgi

        • Protéine Sar 1

          • Assemblage COPII au réticulum endoplasmique

        • ?

          • Assemblage clathrine à la membrane plasmique

      • Rab : amarrage des protéines de transport

      • Etc…

    • Etc…

  • Trimériques

    • Protéines G


Formation of secretory vesicles in the biosynthetic pathway ReviewSylvie Urbé, Sharon A. Tooze and Francis A. BarrBiochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research Volume 1358, Issue 1 , 21 August 1997, Pages 6-22

Protéines de formation des vésicules recouvertes de COP I- et COP II


GTPases de recrutement du manteau : les acteurs

  • Membrane du RE

  • Sar 1 GDP (= GTPases de recrutement du manteau) forte concentration, cytosolique, inactive

  • GEF (Guanine-nucleotide-Exchange Factor)


GTPases de recrutement du manteau : la séquence

  • Une vésicule à COPII est sur le point de bourgeonner (du RE)

  • Une GEF spécifique (protéine de membrane du RE appelée Sec 12) se lie à la Sar 1 du cytosol

  • et remplace le GDP de la Sar 1 par du GTP

  • La Sar 1 GTP libère une queue d'acide gras lui permettant de se fixer dans la membrane du RE

  • puis recrute des sous-unités de COPII

  • La membrane bourgeonne en incluant des protéines membranaires sélectionnées


Fig 13-10

Formation d'une vésicule à COPII


Désassemblage du manteau

  • GTPases de recrutement du manteau

  • Hydrolyse du GTP en GDP

  • La queue est exclue de la membrane

  •  désassemblage du manteau

  • C'est le temps qui finit par déclencher l'hydrolyse


Éléments d'approche

  • Les types de vésicules

  • Assemblage du manteau (les GTPases)

  • Guidage du transport (les SNARE)

  • Amarrage (protéines Rab)

  • Fusion


3 - Guidage du transport

  • Reconnaissance vésicule de transport  membrane cible

  • Toutes les vésicules de transport ont des marqueurs de surface spécifiques de leur origine et de leur cargo

  • Les membranes cible ont des récepteurs complémentaires


Reconnaissance vésicule de transport  membrane cible

  • SNAREs

    • Spécificité

    • Catalyseur de la fusion

  • Rabs (GTPases cible)

    • Amarrage initial

    • Fixation de la vésicule

    • En collaboration avec d'autres protéines


rab GTP-Binding Proteins

A large family of MONOMERIC GTP-BINDING PROTEINS that play a key role in cellular secretory and endocytic pathways


Abréviations

  • SNAREs : SNAP receptors

  • SNAPs : soluble NSF attachment proteins

  • NSF : N-ethylmaleimide-sensitive-fusion protein


Fig 13-11

Rôle des SNAREs dans le guidage des vésicules de transport


SNAREs

  • Au moins 20 espèces différentes

  • Protéines trans-membranaires

  • Marchent par deux :

    • v- SNAREs (vesicle)

    • t- SNAREs (target = cible)

  • Domaine hélicoïdal qui s'enroule l'un dans l'autre  complexe trans–SNARE qui contribue à la fusion des membranes


Complexe trans–SNARE

  • Toujours 4 hélices 

    • 3 formées par t-SNARE

    • 1 formée par v-SNARE

  • Ici 3 protéines

    • v-SNARE 1 hélice (synaptobrévine)

    • t-SNARE 1 hélice (syntaxine)

    • t-SNARE 2 hélices (Snap25 : protéine périphérique)


Fig 13-12

Structure de SNAREs appariés dans les terminaisons nerveuses


SNAREs nerveuses

  • Cibles de neurotoxines

    • Tétanos

    • Botulisme

  • Protéases qui entrent dans des neurones spécifiques, clivent les SNAREs et bloquent la transmission synaptique


Désassemblage du complexe trans-SNARE

  • Après fusion le complexe SNARE est stable dans la membrane

  • Doit être désassemblé 

  • NSF (N-ethylmaleimide-sensitive-fusion protein)


NSF

  • Cycle entre les membranes et le cytosol

  • Catalyse le désassemblage

  • ATPase

  • Ressemble à une chaperone cytosolique qui solubilise et aide à replier correctement les protéines dénaturées

  • Déroule les hélices des SNAREs

  • en collaboration avec des protéines adaptatrices


Fig 13-13

Dissociation d'une paire v-SNARE t-SNARE par NSF une fois le cycle de fusion terminé

NSF + des protéines adaptatrices  hydolyse ATP +séparation des SNAREs

La dissociation régule quand et où les membranes vont fusionner


Éléments d'approche

  • Les types de vésicules

  • Assemblage du manteau (les GTPases)

  • Guidage du transport (les SNARE)

  • Amarrage (protéines Rab)

  • Fusion


4 – Amarrage

  • Rôle important des protéines Rab dans la spécificité du transport vésiculaire


Protéines Rab

  • GTPases monomériques

  • Plus de 30 membres  la plus grande sous-famille de GTPases monomériques

  • Distribution caractéristique sur les membranes cellulaires

  • Chaque organite a au moins une protéine Rab sur sa face cytosolique

  • Facilitent et régulent

    • Le taux d'amarrage des vésicules

    • et l'appariement des v-t- SNAREs


Table 13-1

  • Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab


Localisation sub-cellulaire de quelques protéines Rab


Protéines Rab

  • Comme les GTPases de recrutement du manteau elles cyclent entre la membrane et le cytosol

  • Comme les GTPases de recrutement du manteau, 2 états :

    • Inactif avec liaison de GDP dans le cytosol

    • Actif avec liaison de GTP associé à une membrane


[c – Contrôle de l'assemblage du manteau : GTP binding proteins (rappel)

  • GTP binding proteins : 2 états

    • Actif avec liaison de GTP

    • Inactif avec liaison de GDP

  • Passage d'un état à l'autre par

    • (GEFs): GDPGTP (monomérique = GTPase )

    • GTPase-Activating Proteins (GAPs) : GTPGDP (trimérique = protéines G) Guanine-nucleotide-Exchange Factors]


Fig 13-14

Rôle des protéines Rab dans l'amarrage des protéines de transport

Sar1COPIIformation de la vésiculeRabSNARE amarrage de la vésicule


Les effecteurs de Rab (1/2)

  • Reconnaissance de Rab (Lié, GTP) par un Rab effecteur

  • Gros complexe protéique

  • Très variable d'une protéine Rab à une autre


Les effecteurs de Rab (2/2)

  • Parfois longues protéines filamenteuses qui limitent le mouvement des vésicules entre des citernes golgiennes adjacentes

  • Se lient à Rab et empêchent l'hydrolyse prématurée du GTP

  • D'autres sont des moteurs qui dirigent les vésicules vers leur destination


Protéines Rab

  • Agissent sur les protéines de contrôle des SNAREs

  • Accélèrent le processus de reconnaissance des SNAREs entre elles

  • Achèvent le verrouillage de la vésicule à sa cible par appariement des SNAREs 

  • prêt pour la fusion

  • Après la fusion, la protéine Rab hydrolyse son GTP lié

  • et retourne dans le cytosol


Éléments d'approche

  • Les types de vésicules

  • Assemblage du manteau (les GTPases)

  • Guidage du transport (les SNARE)

  • Amarrage (protéines Rab)

  • Fusion


5 – Fusion

  • Distinguer amarrage de fusion

  • Fusion ne fait pas toujours suite à amarrage :

    • eg : exocytose régulée

  • Amarrage : les protéines des membranes interagissent et adhèrent

  • Fusion : les couches lipidiques peuvent se joindre  nécessité d'extrusion d'eau  protéines de fusion pour résoudre le problème énergétique ( dynamine au cours du bourgeonnement des vésicules à clathrine)


Fig 13-15

Modèle de concentration des protéines SNAREs au cours de la fusion de membrane

Des liposomes (in vitro)v-SNAREs + des liposomes t-SNAREs  fusion lente 

Intervention (dans la cellule) d'autres protéines

pour initier la fusion

ou pour retirer des protéines inhibitrices


Importance des phénomènes de fusion de membrane

  • Transport vésiculaire

  • Fécondation (fusion oolemme spermatozoïde)

  • Fusion des myoblastes

  • Maintien de l'identité des cellules

  • Maintien de l'identité des compartiments intra-cellulaires

  • Mode d'entrée des virus à enveloppe dans les cellules


Analogie protéines de fusion virales  SNAREs

  • Human Immunodeficiency Virus (HIV)

    • Se lie aux récepteurs de la surface de la cellule

    • Les membranes de la cellule et du virus fusionnent

    • L'acide nucléique viral entre dans la cellule et s'y réplique

  • Virus influenza

    • Entrée du virus dans la cellule par endocytose

    • Arrivée dans l'endosome

    • Activation d'une protéine de fusion de l'enveloppe virale

    • Fusion de la membrane virale et de la membrane endosomale

    • L'acide nucléique viral entre dans le cytosol et s'y réplique


Fig 13-16

Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule


Entrée d'un virus à enveloppe dans la cellule

  • Liaison de HIV à la protéine CD4 à la surface des lymphocytes…

  • …par l’intermédiaire de la protéine virale gp120 liée à la protéine de fusion de HIV

  • Une 2ème protéine de surface de la cellule hôte qui sert normalement de récepteur aux chimiokines agit avec gp120 

  • Séparation de gp120 et de la protéine de fusion 

  • Enfouissement de la partie hydrophobe de la protéine de fusion dans la membrane

  • La protéine de fusion (trimère) se comporte transitoirement comme une protéine de membrane dans deux membrane opposées 

  • Réarrangement spontané de la protéine de fusion qui se collabe en une structure compacte de 6 hélices 

  • Libération d’énergie  rapprochement des membranes


Résumé

  • Les manteaux

  • GTPases (Sar1 et ARF)

  • GTPases (Rab)

  • SNAREs


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