二、微生物工程的定义

1. 二、微生物工程的定义 微生物工程 利用生物特性和发酵理论，通过现代化的工程技术手段，进行工业化规模生产，使受培养的微生物积累所需产品的一门技术学科。 微生物工程组成

2. 三、微生物工程的研究内容 菌种的特性与选育 培养基的配制、选择及其灭菌理论 上游工程 发酵醪的特性 发酵机理 发酵过程动力学 空气除菌 微生物对氧的吸收与利用 微生物的培养方式及自动化控制等 发酵工程

3. 下游工程 发酵液预处理 初步纯化（即提取） 高度纯化（即精制） 成品加工 微生物过程废弃物的处理

4. 发酵的流程 碳源、氮源、无机盐等营养物质 保藏菌种 空气 斜面活化 空气净化处理 扩大培养 种子罐 灭菌 主发酵 产物分离纯化 成品

5. 1．天然发酵期：只知其然而不知其所以然的时期1．天然发酵期：只知其然而不知其所以然的时期 2．奠基期：纯培养技术的建立是第一代微生物发酵技术 3．发展期：一系列新技术的建立，使微生物发酵技术得到快速发展 4. 第三代微生物发酵技术 一微生物工程

6. 一、微生物工程在医药工业中的应用 二、微生物工程在食品工业中的应用 三、微生物工程在农业中的应用 四、微生物工程在化工能源领域中的应用 五、微生物工程在环保领域的应用 六、微生物工程在冶金领域的应用 七、微生物工程在高新技术研究中的应用

7. 第五节 微生物工程的发展趋势 （1） 与微生物生态学相结合，研究传统酿造工业 （2） 与遗传学相结合，改良菌种，生产出更多更好的产品 （3） 与化学工程结合，使生产向大型化连续化方向发展 （4） 与计算机科学技术结合，使生产向自动化方向的发展

8. 第一节 微生物工程对菌种的要求 一、微生物的特性 • 体积小、面积大， • 吸收快、转化快， • 生长旺、繁殖快， • 易变异、适应性强， • 种类多、分布广

9. 二、工业化对菌种的要求 1，能够利用廉价的原料来高效地合成产物。 2，菌种遗传性能要相对稳定。 3，菌种改造的可操作性要强。 4，不易感染噬菌体。 5，产生菌及其产物应该无毒。 6，生产特性要符合工艺要求。

10. 二、分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 (1)认真考虑它所需产品的特征和生产过程； (2)制订初步的筛选标准； (3)将生态学方法运用到分离和筛选过程。

11. 三、新种分离与筛选的步骤 定方案 采 样 增 殖 分 离 发酵性能测定

12. 第四节 生产用菌种的选育 工业菌种的选育： 是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。

13. 菌株选育方法 基因突变： 自然选育、诱变育种 基因重组： 杂交、原生质体融合、基因工程 基因的直接进化： 点突变、易错PCR、同序法 DNA Shuffling等

14. 工业菌种改良方法 (1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤 (2)增加前体物的浓度 (3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。 (4)抑制或消除产品分解酶。 (5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。

15. 一、自然选育 自然选育操作步骤： 一般习惯上将自然选育称为菌种的分离纯化。 单细胞(孢子)悬液的制备 平板分离 挑选单菌落(注意形态的观察) 发酵试验

16. 营养缺陷型的选育 专题 • 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸、维生素和碱基等的能力，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 • 与营养缺陷型对应的是野生型。

17. 筛选营养缺陷型的步骤 • 诱变 • 淘汰野生型 抗生素法、菌丝过滤、高温杀菌 • 检出缺陷型 点植法、影印、限量补充培养 • 确定生长谱 缺陷菌株对生长因子的需求情况（维生素、氨基酸、碱基）

18. 宿主细胞必须符合以下条件： １、对载体的复制和扩增没有严格的限制； ２、不存在特异的内切酶体系降解外源DNA； ３、重组DNA增殖过程中，不会对它进行修饰； ４、重组缺陷型，不会产生体内重组； ５、容易导入重组DNA分子； ６、符合重组DNA操作的安全标准。

19. 一、理想的菌种保藏方法应具备的条件 长期保持菌种原有的优良性状，简便、经济。 二、菌种保藏基本原理 菌种保藏一般采取降低培养基的营养成分、低温、干燥和真空等方法。

20. 三、微生物菌种保藏技术 ㈠斜面保藏法和矿物油保藏法 ㈡沙土管干燥保藏法 ㈢真空冷冻干燥保藏法 ㈣液氮保藏法 ㈤低温保藏法 ㈥悬液保藏法

21. 分解代谢(catabolism) 代谢 合成代谢(anabolism) 第一节 微生物的代谢类型 代谢（metabolism）： 细胞内发生的各种化学反应的总称 分解代谢 复杂分子 （有机物） [H] 简单小分子 ATP 合成代谢

22. 分解代谢和合成代谢间的联系 中间代谢产物的重要性

23. 微生物糖代谢的途径 EMP途径，又称糖酵解途径或已糖二磷酸途径 HMP途径（Hexose monophosphate pathway ）， 又称PPP途径或己糖-磷酸途径 ED途径（Entner-Doudoroff pathway）， 又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸裂解途径或KDPG途径 TCA循环（tricarboxylic acide cycle），即三羧酸循环

24. EMP途径的生理功能： ①供应ATP形式的能量和NADH2形式的还原力； ②是连接其它几个重要代谢途径的桥梁，包括三羧酸循环(TCA)、HMP途径和ED途径等； ③为生物合成提供多种中间代谢物； ④通过逆向反应可进行多糖的合成。

25. ①供应合成原料，提供多种形式的C架； HMP途径在生命活动中的意义： ②产生大量的还原力NADPH+H+； ③是光能和化能自养微生物固定CO2的重要中介； ④扩大碳源利用范围，为微生物利用C3－C7多种碳源提供了必要的代谢途径； ⑤连接EMP途径，可为生物合成提供更多的戊糖。

26. ED途径的特点： ①具有一特征性反应――KDPG裂解为丙酮酸和3－磷酸甘油醛； ②存在一特征性酶――KDPG醛缩酶； ③其终产物2分子丙酮酸的来历不同，即一个由KDPG裂解而来，另一个由EMP途径转化而来。

27. TCA循环的特点： ①氧虽不直接参与反应，但必须在有氧的条件下运转（因NAD＋和FAD再生时需氧）； ②产能效率极高； ③TCA位于一切分解代谢和合成代谢中的枢纽地位，为微生物的生物合成提供各种碳架原料。

28. EMP、HMP和TCA循环是重要的兼用代谢途径 在兼用代谢途径中，合成途径并非分解途径的完全逆转；在分解与合成代谢途径中，在相应的代谢步骤中，往往还包含了完全不同的中间代谢物。 代谢物回补顺序：又称补偿途径或添补途径，就是指能补充兼用代谢途径中因合成代谢而消耗的中间代谢物的反应。 乙醛酸循环

29. 4，代谢速度的调控 微生物细胞的代谢调节主要类型 酶合成的调节，调节的是酶分子的合成量。 在遗传学水平上发生的 酶活性调节，调节的是已有酶分子的活性。 在酶化学水平上发生的

30. 4.1 酶合成的调节 粗调 • 根据酶合成的方式，细胞内的酶可分为两大类：一类是组成酶；另一类是诱导酶。 • 凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。 • 能阻碍酶生物合成的现象，则称为阻遏。 以酶的合成系统为基础的酶量调节，包括底物对酶合成系统的诱导作用和产物对酶合成系统的阻遏作用。

31. 酶合成的调节 与调节酶活性的反馈抑制等相比，调节酶的合成（即产酶量）而实现代谢调节的方式是一类较间接而缓慢的调节方式。 优点：通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。 在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者是同时存在且密切配合、协调进行的。

32. 细调 4.2 酶活性的调节 概 念 • 酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。 • 影响因素 • 底物和产物的性质和浓度 • 环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等) • 其他的酶的存在 • 调节方式 • 激活已有酶的活性 • 抑制已有酶的活性

33. 初级代谢和次级代谢 一般将微生物通过代谢活动所产生的自身繁殖所必需的物质和能量的过程，称为初级代谢,该过程所产生的产物即为初级代谢产物，如氨基酸、核苷类，以及酶或辅酶等。 次级代谢是指微生物在一定的生长时期，以初级代谢产物为前体，合成一些对于该微生物没有明显的生理功能且非其生长和繁殖所必需的物质的过程。这一过程的产物，即为次级代谢产物，如抗生素、激素、生物碱、毒素及维生素等。

34. 二、 初级代谢的调节 • 产能代谢的调节：能荷调节(Energy Charge Regulation) • 核蛋白体合成的调节（Regulation of Ribosome Synthesis） • 氨基酸、核苷酸合成代谢的调节（Regulation of amino acids and nucleotide metabolism）

35. 三、次级代谢的调节 • 初级代谢对次级代谢的调节 • 碳代谢物的调节作用 • 氮代谢物的调节作用 • 磷酸盐的调节作用 • 次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用 • 次级代谢中细胞膜透性调节

36. 第三节 微生物的代谢调控和代谢工程 一、微生物代谢产物的利用 利用微生物代谢过程中产生的众多代谢产物生产各种发酵产品。 按照积累产物类型： 初级代谢产物，如氨基酸、核苷类，以及酶或辅酶； 次级代谢产物，抗生素、激素、生物碱、毒素及维生 素等。 按照发酵类型： 自然发酵：酒精、乳酸等， 代谢控制发酵：终端产物，赖氨酸、鸟苷酸、腺苷酸等； 中间产物，柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、 高丝氨酸、肌苷酸、黄苷酸等；

37. 第四章 发酵工艺条件的确定 第一节 培养基的选择和确定 第二节 温度对发酵的影响及控制 第三节 发酵过程的pH控制 第四节 氧、二氧化碳和泡沫对发酵的 影 响与控制 第五节 微生物培养过程的参数检测

38. 第一节 培养基的选择和确定 一、培养基的营养成分 二、培养基的用途 三、发酵培养基的选择 四、发酵培养基成分的营养与作用 五、发酵培养基确定方法

39. 二、培养基的用途 • 筛选菌种 • 保藏菌种 • 检验杂菌 • 培养种子 • 发酵生产 （一）、培养基的分类 （二）、发酵生产中的培养基类型

40. （一）、培养基的分类 （1）按培养基组成物质的化学成分 合成培养基、天然培养基 （2）按物理性质 固体培养基，液体培养基 （3）按用途 选择性培养基、鉴别培养基、富集培养基等

41. 五、培养基确定方法 （1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习性、生理生化特性和一般的营养要求。 （2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。

42. 第二节 温度对发酵的影响及控制 微生物可生长的温度范围较广:-10-95℃。 任何微生物的生长都需要有最适的生长温度，在此温度范围内微生物生长繁殖最快。 在生物学范围内通常每升高10℃，生长速度就加快一倍，所以温度直接影响酶反应，对于微生物来说，温度直接影响其生长和合成酶。

43. 二、温度的影响与控制 （一）温度对发酵的影响 1、温度影响反应速率 发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。 从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2 积分得E= E——活化能 Kr——速率常数

44. 温度变化及其控制 2、温度影响发酵方向 3、温度还影响基质溶解度，同时氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。 因此对发酵过程中的温度要严格控制。

45. 小 结 温度对发酵的影响： 温度影响反应速率 温度影响发酵方向 发酵过程引起温度变化的因素 发酵热是引起发酵过程温度变化的原因 Q发酵＝Q生物＋Q搅拌－Q蒸发－Q辐射 最适温度的选择 根据菌种 生长阶段选择 根据培养条件选择 菌种的生长情况

46. 小 结 • 发酵过程的pH控制 发酵过程pH会发生变化 变化原因 基质代谢 产物形成 菌体自溶

47. 2、溶氧对发酵的影响 由此可知，只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。如果溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢受到干扰。 氧是制约发酵进行的重要因素

48. 根据需氧不同，可将初级代谢发酵分为： a. 供氧充足条件下，产量最大；若供氧不足，合成受强烈抑制；如：谷氨酸，精氨酸，脯氨酸等； b.供氧充足条件下，可得最高产量；若供氧受限，产量受影响不明显；如：异亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸等； c.若供氧受限，细胞呼吸受抑制时，才获得最大量产物；若供氧充足，产物形成反而受抑制；如：亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸等。

49. （二）起泡的危害 降低发酵设备的利用率 增加了菌群的非均一性 增加了染菌的机会 导致产物的损失 消泡剂会给后提取工序带来困难

50. 3、对消泡剂的要求 （1）在起泡液中不溶或难溶 （2）表面张力低于起泡液 （3）与起泡液有一定程度的亲和性 （4）与起泡液不发生化学反应 （5）挥发性小，作用时间长 4、常用消泡剂的种类和性能 （1）天然油脂 （2）聚醚类消泡剂 （3）高碳醇 （4）硅酮类