Molekulārā Ģenētika

1. Molekulārā Ģenētika Cilvēka Genoms: Bioloģija un Medicīna • Ievads • Molekulārās Ģenētikas Pamati • Gēnu Aktivitātes Regulācija • Cilvēka Genoma Projekts • Tests I • Cilvēka Genoms I • Cilvēka Genoms II • Genoma Variācijas • Tests II • Monogēnās un Kompleksās Slimības • Farmakoģenētika (& koronārā sirds slimība) • [Imunoglobulīnu gēni] • [Vēža molekulārā bioloģija] • Tests III • Parādi (vai eksāmens) • Laimīgu Jauno Gadu!  http://priede.bf.lu.lv - Studiju materiāli / MolekularasBioloģijas / MolGen / LV

2. J. Watson (~ 1988) par Cilvēka Genoma Projekta mērķi: “…to find out what being human is."

3. CILVĒKA GENOMA PROJEKTS 1984 - ideja par cilvēka genoma sekvenēšanu • Robert Sinsheimer • diskusijas - to be or not to be • mitohondriju genoms jau bija noteikts (1981) 1988 - ASV National Research Council rekomendē projektu 1990 - 15-gadu projekts ar budžetu 3 miljardi $ oficiāli uzsākts ASV • NIH (National Institutes of Health) un DOE (Department of Energy) • James Watson (līdz 1992), Francis Collins (līdz finišam) 20 genoma centri - ASV, UK,Japāna, Francija, Vācija, Ķīna International Human Genome Sequencing Consortium (IHGSC)

4. Projekta uzdevumi sniedzās tālu ārpus cilvēka genoma sekvences noteikšanas

5. Projekts norisēja trijos posmos 2003 sacensība par genomu

6. Kā noteikt DNS sekvenci? • amplificēt • iegūt vienpavediena DNS • sekvenēt • nolasīt • 500 - 700 bp

7. DNS (fragmentus) var amplificēt divējādi

8. Molecular Biology of the Gene, 5th Edition katalīze praimeris bāzu sapārošana matrica pirofosfatāze praimeris sintezējamā DNS pavediena ‘augošais’ gals bāze Atgādinājums par to, kā dabā notiek DNS sintēze (replikācija) matricas DNS pavediens vienpavediena DNS divpavediena DNS

9. 2’, 3’- didezoksi ATF 2’- dezoksi ATF praimeris praimeris Sanger (1975-77) didezoksi (ķēdes terminācijas) metode

10. divpavedienu DNS praimeris radioaktīvi iezīmēts praimeris vai kāds no nukleotīdiem vienpavediena DNS gēls Sanger (1975-77) didezoksi (ķēdes terminācijas, enzimātiskā) metode

11. Fluorescentās iezīmes (1986 - ...) fluorescenti iezīmēti ddNTF sekvenēšanas reakcijas kapilārā elektroforēze detektors dators Genomes, 2nd Edition

12. Automātiskie sekvenatori (1986 – 1989 - 1998)

13. Automatizēti paraugu sagatavošanas konveijeri

14. Lētāk, ātrāk, vairāk – cilvēka genoma projekts kļūst realizējams plānotajos termiņos

15. Kā noteikt genoma sekvenci? • sašķelt fragmentos, izveidot bibliotēku • sekvenēt fragmentus, t.i., klonus • atrast pārklājošās sekvences (dators) • konstruēt nepārtrauktus fragmentu blokus (dators) • aizpildīt pārtraukumus starp šiem blokiem • līdz 5 miljoni bp, t.i., baktēriju genomi “SHOTGUN” metode

16. Genoma bibliotēkas izveidošana šķeļ fragmentos klonē plazmīdās rekombinantās DNS transformē baktērijas genoma (fragmentu) bibliotēka

17. “Shotgun” metodes (1981) princips DNS fragmenti individuālas sekvences pārklāšanās Genomes, 2nd Edition

18. “Shotgun” metodes (1981) princips Individuālas sekvences Dators atrod pārklājošās sekvences un konstruē nepārtrauktu sekvenču bloku – “contig”(contiguous block of sequence) “Contig” Recombinant DNA, 3rd Edition

19. Nepārtrauktu “contig” bloku konstruēšana minisekvences “Scaffold” - nepārtraukts “contig” bloks – sets of contigs joined by paired reads from both ends of plasmid inserts Molecular Biology of the Gene, 5th Edition

20. Genoma sekvence Individuālas sekvences Dažādi genoma rajoni nav vienlīdzīgi pārstāvēti genoma bibliotēkā Genomes, 2nd Edition • 1x pārklājums – noteikto bp skaits = genoma izmēram: • 1x pārklājums ~ 63% no genoma sekvences • 6x – 99.75% • 10x – 99.995%

21. Visa genoma (whole-genome) “shotgun” (1995) 1.8 miljoni bp DNS iegūšana dažāda garuma DNS fragmenti DNS fragmentē ar ultraskaņu (‘sonicate’) elektroforēze agarozes gēlā DNS ekstrakcija no gēla 1600-2000 bp DNS fragmenti klonu bibliotēkas iegūsana sekvenē insertu galus galu sekvences nepārtrauktu fragmentu bloku konstruēšana Genomes, 2nd Edition

22. Starp blokiem parasti ir pārtraukumi sekvences pārtraukumi fizisks pārtraukums Genomes, 2nd Edition

23. Pārtraukumu aizpildīšana Sekvences pārtraukuma aizpildīšana – izmanto esošos klonus Fiziska pārtraukuma aizpildīšana – izveido jaunu bibliotēku cita tipa vektorā Genomes, 2nd Edition

24. 1743 proteīnus kodējošie gēni Recombinant DNA, 3rd Edition

25. Palielinoties genoma izmēram, t.i., analizējamo fragmentu skaitam, datu analīze kļūst neproporcionāli kompleksāka Eikariotu genomu gadījumā viegli var rasties kļūdas dēļ atkārtoto genoma elementu lielā īpatsvara: Problēmas ar tandēmiskajiem atkārtojumiem tandēmiskais atkārtojums DNS fragmenti sekvences kļūdains bloks Problēmas ar izkliedētajiem atkārtojumiem izkliedētie atkārtojumi DNS fragmenti sekvences kļūdains bloks Genomes, 2nd Edition Tīrā veidā “shotgun” nav piemērots eikariotu genomiem

26. Kā noteikt eikariota genoma sekvenci? • konstruēt genoma karti • izveidot dažāda izmēra bibliotēkas • pielietot kādu no “shotgun” variantiem • der visam (vismaz viens) , t.sk., cilvēka genomam

27. Genoma kartes veido marķieri, kuru (relatīvais) izvietojums zināms Marķieri Genoma kartes • ģenētiskā • marķieri (polimorfismi) • ‘slimību’ gēnu identifikācija • fizikālā • STS marķieri un klonu bibliotēkas • genomu sekvenēšanas projekti • gēnu izolēšana Genomes, 2nd Edition

28. Fizikālā karte un tās izmantošanas princips klonu bibliotēka DNS sekvence STS (marķieri) Genomes, 2nd Edition STS – sequence tagged site – īsa un unikāla DNS sekvence (100-500 bp)

29. Divas alternatīvas “shotgun” metodikas eikariotu genomu sekvenēšanai Marķieri Visa genoma “Shotgun” Hierarhiālais “Shotgun” (klonu “contig”metode) Genoma karte Kartēts segments Visa genoma Shotgun sekvenēšana kartētā segmenta Shotgun sekvenēšana konstruētais fragmentu bloks konstruētais fragmentu bloks bloka pozīcija hromosomā vēl jāatrod bloka pozīcija hromosomā jau zināma Genomes, 2nd Edition

30. Cilvēka Genoma Projekts izvēlējās un realizēja hierarhiālo “shotgun” Hierarhiālā “shotgun” jeb klonu “contig” metodes princips Cilvēka genomiskā DNS BAC klonu bibliotēka (bacterial artificial chromosome) satur > 100 – 200 kb garus fragmentus Izveidoja BAC klonu “contig” (fingerprints, galu sekvenēsana, STS) un pēc marķieriem noteica to pozīciju genomā Katram BAC klonam veica shotgun sekvenēšanu

31. Lielu genoma fragmentu klonēšanai izmantotie vektori Recombinant DNA, 3rd Edition

32. Lielizmēra klonu “contig” kartes konstruēšana Cilvēka genoma DNS Iegūst 10-kārtīgu lielizmēra insertus saturošu klonu bibliotēku Konstruē klonu “contig” karti Izvēlas minimālo klonu kolekciju, kas pārklāj visu genomu Izvēlēto kolekciju izmanto tālākam darbam (“shotgun” metodei, t.i., katra lielā klona fragmentu atkal sašķeļ un iegūtos mazākos fragmentus klonē un sekvenē) Recombinant DNA, 3rd Edition

33. Lielizmēra klonu “contig” kartes konstruēšana STS kartēšana Restrikcijas fingerprints Klonēti DNS fragmenti STS-specifiski PCR Restrikcija Diviem kloniem kopēji restrikcijas fragmenti Diviem kloniem kopēji STS Genomes, 2nd Edition

34. Cilvēka Genoma Projekts Kompānija Celera Genomics Karš par genomu

35. Aptuvenās (‘draft’) sekvences (90% eihromatīna, > 100 000 pārtraukumu) - 2001 Cilvēka Genoma Projekts Kompānija Celera Genomics Karš par genomu

36. Genoma sekvences pabeigšana (Cilvēka Genoma Projekts) BAC klons Sekvence Pārtraukums, kuram nav mazizmēra klonu Pārtraukums, kuram ir 3-kb kloni Rajons, kam raksturīga zemas kvalitātes sekvence Atkārto klonu sekvenēšanu PCR Sekvenē klonus PCR produktu sekvenēšana Pārtraukums aizpildīts ar sekvenci Pārtraukums aizpildīts ar sekvenci Kvalitatīva sekvence Recombinant DNA, 3rd Edition

37. 99% eihromatīna sekvences ar precizitāti > 99.99%

38. Recombinant DNA, 3rd Edition

39. Recombinant DNA, 3rd Edition

40. Cilvēka genoma saturs procenti introni retrovīrusiem līdzīgie elementi proteīnus kodējošie rajoni DNS transpozonu ‘fosīlijas’ GĒNI TRANSPOZONI citas DNS sekvences vienkāršie sekvences atkārtojumi segmentu duplikācijas ATKĀRTOTĀS SEKVENCES UNIKĀLAS SEKVENCES

41. Jaunas tehnoloģijas tuvina cilvēka genoma sekvenēšanu rutīnai 2010 Mērķis $ 100 000 $ 1000

42. genoma fragmentēšana, adapteru ‘piešūšana’ un • vienpavediena DNS iegūšana • fragmentu piesaistīšana lodītēm un • PCR atsevišķos emulsijas pilieniņos 1 2 • imobilizētu sekvenēšanas fermentu pievienošana 4 • amplificētās DNS denaturācija un • ievietošana optiska slaida bedrītēs 3 pirosekvenēšana 5 Izmantotās 2. paaudzes sekvenēšanas tehnoloģijas princips Nature (2005) 437, 376 – 380. Standarttehnoloģija – klonēšana un fragmentu individuāla sekvenēšana Dotā tehnoloģija – in vitro un 100 000 fragmentu vienlaicīga sekvenēšana

43. Nukleotīdu secības noteikšanai tika izmantota PIROSEKVENĒŠANAS metode www.pyrosequencing.com APS - adenozīnfosfosulfāts

44. 1953. gads: F. Crick un J. Watson atšifrē DNS struktūru 2008. gads: J. Watson saņem savas atšifrētās DNS digitālo versiju

45. Kā ar Dr. J. Watson genoma informācijas izmantošanu klīniskajā praksē? Bentley DR (2004) Genomes for medicine. Nature, 429, 440-445. Individual sequence of James Watson

46. (HGDM – Human Gene Mutation Database) Pagaidām vēl Dr. Watson u.c. mirstīgo personalizētās genomiskās medicīnas ēra nav pienākusi, kaut arī viņam konstatēja 12 mutācijas, kas izraisa monogēnās slimības un 20 variantus, par kuriem ziņots, ka tie paaugstina saslimšanu risku.

47. Pagaidām vēl Dr. Watson u.c. mirstīgo personalizētās genomiskās medicīnas ēra nav pienākusi, kaut arī viņam konstatēja 12 mutācijas, kas izraisa monogēnās slimības un 20 variantus, par kuriem ziņots, ka tie paaugstina saslimšanu risku. “It was so profound, how little we were actually able to say about that... To me, it really proved that this is the beginning, not the end.” (atziņa pēc konsultatīvās sesijas)

48. (2002) 3, 44 Par laimi, līdztekus genoma sekvenēšanai, attīstījušās arī citas “-omiskās” tehnoloģijas Genomika + genotipēšana Transkriptomika Proteomika Dzīvnieku modeļi Pieminekli Pelei! + Bioinformātika

49. Tā izskatās Mikročipi

50. mRNS analīzes princips