酶工程
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酶工程. 生物技术 的 四大支柱. 酶的基础知识. 一 什么是酶?. Enzyme proteins 酶是由生物体产生的具有催化剂活性的蛋白质 。 Ribozyme RNAs 本身就是一段 RNA ,不需要额外的蛋白酶就可以对自身进行剪切。. 二 酶催化特性. 高效率 比非催化高 10 8 - 10 20 倍 比非酶催化高 10 7 - 10 13 倍 高度专一性 反应条件温和 酶催化是可调控的. 三 酶的化学本质. Enzyme Proteins Ribozyme RNAs. 四 酶的组成. 简单酶 酶 结合酶

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生物技术的四大支柱



一 什么是酶?

  • Enzyme proteins

    • 酶是由生物体产生的具有催化剂活性的蛋白质 。

  • Ribozyme RNAs

    • 本身就是一段RNA,不需要额外的蛋白酶就可以对自身进行剪切。


  • 二 酶催化特性

    • 高效率

      比非催化高108-1020倍

      比非酶催化高107-1013倍

    • 高度专一性

    • 反应条件温和

    • 酶催化是可调控的


    三 酶的化学本质

    • Enzyme Proteins

    • Ribozyme RNAs


    四 酶的组成

    简单酶

    结合酶

    辅酶 Coenzyme

    辅因子

    辅基 Prosthetic group (Table 2)

    Holoenzyme

    Apoenzyme

    Cofactor


    五 酶的命名与分类

    原则:

    • 根据酶所用的底物来命名

      Ribonuclease

      Protease

    • 根据所催化的反应来命名

      Dehydrogenase

      Phosphotransferase

      Aminotransferase

    • 上述两个原则结合

    • 上述原则再加上酶的来源

      牛胰核糖核酸酶


    (一)国际系统分类法

    • 氧化还原酶类 Oxidoreductases

    • 转移酶类 Transgerases

    • 水解酶类 Hydrolases

    • 裂合酶类 Lyases

    • 异构酶类 Isomerases

    • 合成酶类 Synthetases

      Synthases


    (二)系统命名法

    • ATP: Creatine Phosphotransferase

      ATP: 肌酸 磷酰基转移酶

    • Glutamate: Pyruvate aminotransferase

      谷氨酸: 丙酮酸 (GPT) 氨基转移酶

    • 单体酶 Monomeric enzymes

    • 寡聚酶 Oligomericenzymes

    • 多酶体系 Multienzyme systems



    酶工程

    • 酶工程即利用酶的催化作用,在一定的生物反应器中,将相应的原料转化成所需的产品。酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技术,它的应用主要集中于食品工业、轻工业和医药工业等领域。


    酶工程的应用范围

    (1)对生物宝库中存在天然酶的开发和生产;

    (2)自然酶的分离纯化及鉴定技术;

    (3)酶的固定化技术(酶和细胞固定化);

    (4)酶反应器的研制和应用;

    (5)与其他生物技术领域的交叉和渗透。

    其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上有了酶的固定化技术,酶在工业生产中的利用价值才真正得以体现。 



    • 放线菌尽管人类19世纪前后才建立起酶的概念,但酶的催化作用却很早就为人们的生活所利用。比如:

      1987年以后,Bucher发现酶的细胞外作用现象,从而导致了酶的商品化生产。


    • 霉菌尽管人类19世纪前后才建立起酶的概念,但酶的催化作用却很早就为人们的生活所利用。比如:

      最初的商品酶制剂主要以动植物为原料提取,如从牛胃中提取凝乳酶、从胰脏中提取胰酶、从血液中提取凝血酶、从植物材料中提取淀粉酶等。 之后,Takamine利用霉菌来生产淀粉酶使得酶制剂工业取得突破,其方法至今仍被采用


    第二次世界大战以后,随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善,利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业,并开辟了广阔的市场。


    Pilot Biostat UD50 第二次世界大战以后,随着微生物培养技术、发酵工业和设备的渐渐完善,利用微生物来获得商品化酶制剂已形成规模化产业,并开辟了广阔的市场。


    20 90

    20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此 “基因工程+发酵工艺+先进的发酵设备”可以算是酶工业的第三次飞跃。

    霉菌


    微生物酶的开发 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    一、应用微生物来开发酶的优点:

    (1)微生物生长繁殖快,生活周期短。因此,用微生物来生产酶产品,生产能力(发酵)几乎可以不受限制地扩大,能够满足迅速扩张的市场需求。

    (2)微生物种类繁多,它们散布于整个地球的各个角落,而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式,能分解利用不同的底物。

    (3)这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。


    微生物酶的开发 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    一、应用微生物来开发酶的优点:

    (4)特别是当基因工程介入时,动植物细胞中存在地酶,几乎都能够利用微生物细胞获得。

    因此,有计划和仔细地筛选微生物菌种,通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当细胞。


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (一) 样品的采集

    采样的目的、采样地点、采样方法及采样的数量。


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (二) 菌种的分离

    培养基的确定、培养条件的确定。


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (三) 菌种的初筛

    (1)用简单的定性反应进行初筛;

    (2)在最初分离阶段就给予特殊的培养基或培养条件,进而让目的菌株得以繁殖,尽可能地把只成为目的菌的菌株或只将其最适菌株的一株纯化分离。


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (四) 菌种的复筛

    初筛之后,还要进行复筛。复筛的目的是在初筛的基础上,筛选产酶量高、性能更符合生产要求的菌种。复筛。

    酶活的测定方法的建立尤其重要。


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (五) 对复筛获得菌株的要求

    (1)不是致病菌;

    (2)菌株不易变易和退化;

    (3)不易感染噬菌体;

    (4)微生物产酶量高;

    (5)酶的性质符合应用的需要,而且最好是胞外酶;

    (6)产生的酶便于分离和提取,得率高;

    (7)微生物培养营养要求低。


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (六) 最佳产酶条件的初步确定

    (1)培养方式的确定;

    (2)最佳培养条件组合;

    (3)微生物产酶的特性(胞内酶、胞外酶);

    (4)微生物酶收集的时间顺序;


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (七) 微生物产酶性能的进一步提高

    (1)获得高产菌种的突变体;


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (七) 微生物产酶性能的进一步提高

    (2)利用代谢工程和代谢调节机理来提高微生物的酶产量;


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (七) 微生物产酶性能的进一步提高

    (3)运用遗传工程、基因工程的手段将原有菌株中的目的基因转移到另外一些对生产环境更适应性的微生物细胞之内,使其高效表达;


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (八) 微生物酶的提取方法

    (1)酶的粗提;

    (2)酶的精制。


    微生物酶开发的一般程序 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    (九) 微生物产酶菌种的保藏

    (1)斜面;

    (2)沙土管;

    (3)冷冻。


    代谢流分析与控制 20世纪90年代,随着基因工程的广泛介入,一些原来只能由动物或植物生产的酶,经过酶基因重组,可以在微生物上表达。由于在发酵过程中很容易对微生物进行控制,因此

    代谢工程是当今国际生化工程界的新兴交叉学科,它将计算机技术、自动控制、基因操作技术与发酵工程结合起来,研究生产过程中细胞代谢流的分布,利用代谢控制理论和网络刚性理论寻找限制代谢流率的代谢瓶颈和代谢网络中制约转化率提高的酶反应,为定向菌种选育和发酵控制提供思路。

    谷氨酸与谷氨酰胺产生代谢网络图


    谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸代谢网络图


    氧化酶诱导产酶机制和发酵动力学研究谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • 一级酶自催化模型

    • One order self-catalytic model:


    实验室工作与谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸工业化生产之间的差异


    微生物酶的应用谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸


    一、蛋白酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸


    洗毛工艺中蛋白酶的应用谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

     生产中经常会发现,洗净毛色泽黯沉,影响后加工的质量和成品的色光。国内外学者研究发现,原毛表面除了含有羊毛脂、羊汗、土杂、草屑污染物外,还存在另一种蛋白质污染物(PCL),它的残存使洗净毛色泽黯沉,采用传统的洗毛方法很难完全去除。为洗除羊毛表面的蛋白质污染物,在洗毛工艺中应用AS1398 中性枯草杆菌蛋白酶,采用二步法洗毛,先使用合成洗涤剂601 洗去羊毛脂、羊汗、土杂,再利用蛋白酶洗去蛋白质污染物,提高洗净毛的质量。


    控制蛋白酶治疗疾病谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • 蛋白酶对冠状病毒的复制起着重要的控制作用,因此如果可以有效抑制住蛋白酶的活性,那么就可以控制住病毒在体内的传播,这样虽然不能预防感染上SARS,但却将会使人类有了治疗SARS的有效药物。一种名为“AG7088”的药物有望在改良后用于治疗SARS。该药物用于治疗鼻病毒(rhinovirus)引起的普通感冒,而控制这种病毒复制的蛋白酶与SARS冠状病毒蛋白酶结构非常相似。科学家认为,AG7088这种正处于临床试验阶段的药物,虽然不能直接抑制SARS冠状病毒蛋白酶,但鉴于两种蛋白酶的相似性,这一药物有望在经过改良后抑制SARS病毒蛋白酶的活动,从而成为对付SARS的良药。


    二、淀粉酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸


    三、纤维素酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸


    四、脂肪酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

     广泛用于化妆品、食品、医药、洗涤剂工业中的生物表面活性剂包括脂肪酸单甘油酯、脂肪酸糖酯、聚甘油脂肪酸酯和长链脂肪酸蜡酯。传统化学法以碱为催化剂在高温下进行, 不仅能耗高且产品纯度低。脂肪酶作为一种天然生物催化剂, 可在温和条件下催化合成上述生物表面活性剂, 能耗低且产品纯度高。


    五、医药生产用酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸青霉素酰化酶

    青霉素酰化酶是一种能转化天然青霉素的酶.它水解苯乙酸和一些密切相关的芳香脂肪酸的酰胺.在适当条件下,它还能催化6-氨基青霉烷酸生成半合成青霉素. 可获得高效、广谱、服用方便的半合成抗生素, 由于这些抗生素在临床上广泛的应用, 从而使青霉素酰化酶的需要量日益增长.青霉素酰化酶常由微生物产生, 分胞内酶及胞外酶两种形式.


    六、特殊的治疗用酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    1. 透明质酸酶(治疗肝炎、肝硬化)2. 血纤维蛋白溶酶(治疗心肌梗塞等)3. L-天冬酰胺酶(治疗可用于治疗白血病)


    • 固定化酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • ——固定化技术及应用


    什么是固定化酶?谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    水溶性酶

    水不溶性载体

    固定化技术

    水不溶性酶

    (固定化酶)


    谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    可溶

    固定化

    间歇

    吸附

    包埋

    交联

    化学偶联

    间歇

    连续

    酶的固定化技术和固定化酶


    固定化酶的特点:谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • 优点:

      • 不溶于水,易于与产物分离;

      • 可反复使用;

      • 可连续化生产;

      • 稳定性好。

    • 缺点:

      固定化过程中往往会引起酶的失活


    固定化技术谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • 微型胶囊法

    • 吸附

    • 通过双功能试剂进行共价交联

    • 胶格包埋

    • 和水不溶性载体共价结合


    谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸固定化酶的方法

    (一)微型胶囊法


    相分离法 酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    硝酸纤维素 -D-半乳糖苷酶

    天门冬酰胺酶

    火棉胶 醇脱氢酶

    苹果酸脱氢酶

    丙酮酸激酶

    脲酶

    界面聚合法 尼龙

    液膜法 聚脲

    液体干燥法 乙基纤维素

    聚苯乙烯


    (二)吸附法谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • 物理吸附法

      • 静止法

      • 电沉积法

      • 反应器上直接吸附法

      • 混合浴或振荡浴吸附法


    优点: 谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸固定化时酶分子的构象很少 或基本不发生变化。

    缺点: 结合力弱,易解吸附。

    载体: 纤维素、琼脂糖、活性炭、 沸石及硅胶等。


    • 离子结合法谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • 酶分子含有离子交换基团的固相载体

    • 第一个离子结合法固定化酶:

    • DEAE — Cellulose

    • 固定化过氧化氢酶

    • 第一个工业化的固定化酶:

    • DEAE-Sephadex A-50

    • 固定化氨基酰化酶


    (三)胶格包埋法谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    • 首先被采用的胶格包埋法是:

      • 固定化胰蛋白酶

      • 木瓜蛋白酶

      • -淀粉酶

    • Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺

    • 引发剂--inactiation


    (四)共价交联法谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    双功能试剂:

    常用的是戊二醛

    O O

    H — C — CH2 — CH2 —CH2 —C — H

    第一篇报道是:戊二醛交联羧肽酶 得到一种分子间交联的固定化酶


    • 谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸7-11 酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联

    • 酶分子;(a)酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶;(b)酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶


    谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸7-2 常用于固定化酶的交联剂

    交联剂 参考文献

    戊二醛 13-16

    二重氮联苯胺-2,2‘-二磺酸 17,18

    4,4‘-二氟-3,3’-二硝基二苯砜 19

    二苯基-4,4‘-二硫氰酸-2,2’-二磺酸 20

    1,5-二氟-2,4-二硝基苯 21

    酚-2,4-二磺酰氯 22

    3-甲氧基二苯基甲烷-4,4‘-二异氰酸盐 23


    (五)共价偶联法谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸


    二 固定化酶在工业生产上的应用谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    乙酰 -DL — Ala L — Ala +乙酸

    乙酰 -D — Ala

    Aminoacylase

    氨 基 酰 化 酶


    固定化酶柱子谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    A-L-Ala

    A-D-Ala

    消旋反应器

    离心机

    反应产物

    L-Ala A-D-Ala

    晶体 L-Ala


    三 固定化酶在医学上的应用谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    (一)酶电极

    (1)葡萄糖电极

    半透膜

    酶胶层

    感应电极

    酶电极示意图

    ß-D-葡萄糖+O2 D-葡萄糖酸-1,5-内酯+H2O


    葡萄糖氧化酶谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸

    葡萄糖+醌+H2O 葡萄糖酸+氢醌

    Pt

    氢醌 醌+2H++2e-

    铂电极


    谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸2)脲电极

    脲酶

    Urea + 2H2O 2NH4++2HCO3-

    产生的2NH4+为阳离子电极感应。

    此外还有: 氨基酸电极

    醇电极

    尿酸电极

    乳酸电极

    青霉素电极

    亚硝酸离子电极:菠菜亚硝酸还原酶产生NH3


    Gd谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸nHCl

    去除

    GdnHCl

    衍生物 C

    衍生物 B

    四 固定化酶在基础研究中的应用

    衍生物 A

    Creatine Kinase

    肌酸激酶(MW 82000, Dimer)


    谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸7-3 固定化肌酸激酶及固定化亚基的蛋白质含量及比活力

    酶的衍生物 蛋白质含量 比活力

    (g/ml 凝胶)(%) (单位/mg)

    衍生物A 400 100 28.0

    衍生物B 210 52.5 25.7

    衍生物C 380 95.0 27.4


    谢谢谷氨酸棒杆菌产生谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、脯氨酸