15. Propiedades de las proteínas
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15. Propiedades de las proteínas. Titulación ácido-base de una proteína. Carga negativa neta. pI. Carga positiva neta. Grupos disociables de una proteína. (Se indica el pK a de la cadena lateral en cada caso). Ácidos (aniónicos, - ) Asp 3.86 Cys10.78 Glu 4.25 Tyr10.07.

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15 propiedades de las prote nas

15. Propiedades de las proteínas


15 propiedades de las prote nas

Titulación ácido-base de una proteína

Carga negativa neta

pI

Carga positiva neta


15 propiedades de las prote nas

Grupos disociables de una proteína

(Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso)

Ácidos

(aniónicos, - )

Asp 3.86

Cys10.78

Glu 4.25

Tyr10.07

Básicos

(catiónicos, + )

Arg12.48

His 6.00

Lys10.53

Aniónicos: carga negativa neta por encima de su pKa

Catiónicos: carga positiva neta por debajo de su pKa


15 propiedades de las prote nas

Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7

Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentan

carga negativa neta.

Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7

Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentan

carga positiva neta.

En el medio biológico, son, por

lo general, más abundantes las

proteínas ácidas.


15 propiedades de las prote nas

Electroforesis

Muestra

1. Se realiza sobre un soporte

sólido o semisólido, para mini-

mizar efectos de difusión

2. Se somete el conjunto a

un campo eléctrico constante,

a un pH fijo; las proteínas migran

conforme a su carga eléctrica

-

+

3. Terminada la carrera electro-

forética, las proteínas se tiñen

con un colorante adecuado

(p.e., Azul de Coomassie)


15 propiedades de las prote nas

Muestra:

tres componentes

mezclados

Fundamento de la cromatografía

Se dispone una mezcla

sobre una fase estacionaria

Fase

estacionaria

Se hace fluir una fase

móvil sobre la estacionaria

Dependiendo de la afinidad

relativa por ambas fases, los

componentes de la mezcla

primitiva se separan

Fase móvil


15 propiedades de las prote nas

Tipos de cromatografía

1. Intercambio iónico

- Separa según carga eléctrica

- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte

insoluble

- Fase móvil: gradiente de sal o de pH

2. Partición

- Separa según solubilidad en solventes

- Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido

- Fase móvil: El otro solvente fluyendo


15 propiedades de las prote nas

3. Afinidad

- Separa según la afinidad de la proteína por un ligando

inmovilizado

- Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble

- Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con

ligando libre

4. Hidrofóbica

- Separa según hidrofobicidad

- Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un

soporte insoluble

- Fase móvil: gradiente inverso de sal

5. Exclusión molecular

- Separa según tamaño molecular

- Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados

- Fase móvil: solución tamponada


15 propiedades de las prote nas

Intercambio iónico

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+

+

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-

Proteínas adsorbidas

al intercambiador

iónico

A mayor concentración

de sal se desprenden

las proteínas más

electronegativas

A baja concentración

de sal, se desprenden

las proteínas menos

electronegativas


15 propiedades de las prote nas

Soportes

cromatográficos


15 propiedades de las prote nas

Cromatografía de

intercambio iónico


15 propiedades de las prote nas

Cromatografía de adsorción a colorantes


15 propiedades de las prote nas

Cromatografía de afinidad


15 propiedades de las prote nas

Solubilidad

pI

pH

Punto isoeléctrico


15 propiedades de las prote nas

Solubilidad

Salting out

Salting in

Fuerza

iónica, (M)


15 propiedades de las prote nas

Solubilidad,

g/L

100

0

0

100

Temperatura, ºC


15 propiedades de las prote nas

Peso molecular de las proteínas

1. Métodos primitivos: presión osmótica, ultracentrifugación

analítica, etc.

2. Cromatografía de exclusión molecular

3. Electroforesis SDS-PAGE

4. Cálculo directo a partir de estructura primaria


15 propiedades de las prote nas

Cromatografía de exclusión molecular


15 propiedades de las prote nas

Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)


15 propiedades de las prote nas

-

-

+

+


15 propiedades de las prote nas

Método de Kjeldahl

Digestión ácida total de la proteína

y conversión cuantitativa de nitrógeno

a NH3, que se valora por titulación.

Poco sensible. En desuso.

Se sigue empleando para análisis

elemental (p.e., alimentos)

Proteína total= N x 100/16


15 propiedades de las prote nas

Absorción a 280 nm

Se fundamenta en la absorción a 280 nm producida

por los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp

- Sensible y fácil de practicar

- Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable

a mezclas

- Distintas proteínas dan diferente grado de absorción,

dependiendo de su contenido en aa. aromáticos


15 propiedades de las prote nas

Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestos

con grupos -CO-NH- dan una coloración violeta.

Muy específica; relativamente poco sensible

Reacción del biuret


15 propiedades de las prote nas

Método de Lowry

Reacción en dos fases:

1. Reacción del biuret

2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu

- Muy sensible (muestras de 10 mg) y sencillo

- Resultados variables con distintas proteínas, pues depende

del contenido en aminoácidos aromáticos


15 propiedades de las prote nas

0.4

0.3

0.2

Colorante

Colorante + proteína

400

500

600

0.4

0.3

0.2

400

500

600

700

Método de Bradford

La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a una proteína

modifica las características de absorción visible de aquél.

Sensible, fácil de practicar y resultados muy constantes

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