DNA’nın Erimesi

1. 42°C’ın üzerindeki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı arasındaki hidrojen köprüleri öncelikle A-T zengin bölgelerde olmak üzere gevşeyip açılmaya başlar. Kullanılan tampon çözeltiye bağlı olarak 56-80°C arasındaki sıcaklıklarda DNA ikili sarmalı kendisini oluşturan nükleotid zincirlerine ayrılır. Buna DNA’nın erimesi denir. DNA heliksinin %50’sinin denatüre olduğu sıcaklığa DNA’nın erime sıcaklığı (Tm) adı verilir. Tm değeri o DNA’nın A-T/G-C oranına bağlı olduğundan, DNA’nın tanımlanmasını sağlayan spesifik bir değerdir. Tm değeri kullanılan tampon çözeltinin iyonik şiddetine ve pH’sına da bağlıdır. Bu nedenle Tm değeri verilirken mutlaka deneyin hangi, şartlarda yapıldığı da belirtilmelidir. DNA’nın Erimesi

3. DNA erimesi sıcaklık 90-100 °C’nin üzerine çıkılmadığı sürece geri dönüşümlüdür. Eğer 80°C’ye ısıtılmış bir DNA çözeltisi, oda sıcaklığında yavaş yavaş soğumaya bırakılırsa iki sarmal tekrar birleşerek DNA ikili sarmalını oluştururlar (hibridizasyon). Ancak aynı DNA oda sıcaklığında değil de bir buz banyosunda ani soğutmaya bırakılacak olursa DNA sarmalarında hibridizasyon gerçekleşmez ve nükleotid zincirleri birleşmezler. Ayrıca DNA boyunda kısalmalar, yani DNA degradasyonu meydana gelebilir. Eğer degradasyon meydana gelmediyse bu çözeltiler yeniden ısıtılıp yavaş yavaş soğumaya bırakılırlarsa DNA ikili sarmalını yeniden oluşturabilirler.

4. DNA’nın Erimesi Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Tekniğinin Temelini Oluşturur. PCR metodu kullanılarak sekuansı (nükleik asit dizilimi) bilinen bir DNA parçasının klonlanması yani çok sayıda kopyasının oluşturulması mümkündür.

5. Bu şekilde 25 döngü sonrasında oligonükleotid 106 kat çoğaltılmış olur.

6. DNA’nın Organizasyonu İster prokaryotlarda, isterse de ökaryotlarda olsun bütün DNA moleküllerinin ortak özelliği çok büyük olmalarıdır. Prokaryotlardan örneğin E.coli kromozumu tek, çok büyüktür ve çember şeklindedir. Ökaryotlarda ise E.coli hücresinin 1000 misli uzun bu molekülün, çok küçük bir hacim içerisine sıkıştırılabilmesi olağanüstü bir olaydır. , Prokaryotik hücreye bağlı spesifik yapısal proteinler bulunmamakla birlikte replikasyon ve transkripsiyonda rol alan enzim ve proteinlerden başka, bu büyük molekülü hücre içerisinde yapılandıran matriks proteinleri de vardır. Ökaryotik hücreler türden türe farklılık gösteren sayıda bir çok kromozom içerir ve her bir kromozom da bir tane çok büyük DNA molekülünden ibarettir. Tek bir memeli hücresindeki DNA ların toplam uzunluğu 2 m den fazladır, baz çiftlerinin sayısı E.coli nin yaklaşık 1000 mislidir ve DNA organizasyonu daha karmaşıktır.

9. DNA yapısında bir gen içindeki protein sentezinde kullanılmayan kısımlar intron olarak adlandırılırlar. Üzerinden mRNA sentezlenerek proteine çevrilen gen kısımlarına ise ekson adı verilir. Ayrıca gen üzerinde düzenleyici nükleotid parçaları vardır.

12. Histonlar DNA histon adı verilen lizin ve arjinince zengin bazik karakterdeki proteinlerle nükleozom adı verilen kompleksler yapar. DNA histonlar dışında transkripsiyon ve replikasyon enzimleri, transkripsion faktörleri ve hormon reseptörleri gibi fonksiyonel proteinlerle de birleşmiş halde olabilir.

17. Kromatin Hücre bölünmediğinde DNA kromatin denilen büyük bir kitle halinde bulunur. Kromatin çekirdekte amorf, rasgele dağılmış gibi gözüken yapılardır. Kromatin yapısında hemen hemen eş miktarda DNA ve protein bulunur. Ayrıca çok az miktarda RNA da mevcuttur. Nükleozomlardan 6-7 tanesinin bir dönüşü oluşturduğu süper sarılmalarla kromatin fibrilleri denilen yapılar oluşur. Her ne kadar kromatin yapısı çok sıkı bir şekilde paketlenmişse de ayrıca dinamik olarak kullanılan bir yapıdır.

18. Kromozom Hücre çoğalmadan önce kromatin mikroskop ile görülebilen hücrenin DNA sının tıpatıp aynı iki kopyasını içeren kromozom denilen yapılara yoğunlaşır. Bu eş kopyalara kardeş kromatid adı verilir bunlar sentrom denilen bölgede birbirlerine tutunmuşlardır Kromozom terimi bir organizmanın genetik bilgisinin saklandığı nükleik asit yapısını ifade eder.

21. Bölünme sırasında kromatidler ayrılır ve her bir yarıma kromozom adı verilir. Bu yolla her yeni hücre orijinal hücrenin DNA kopyasını içerir.

22. DNA REPLİKASYONU Watson ve Crick oğul DNA molekülündeki zincirlerden birinin yeni sentezlendiğini ve diğerinin atasal DNA molekülünden ileri geldiğini öne sürmüşlerdir. DNA sentezi yarı korumalıdır Yani DNA molekülünden bir başka DNA molekülünün sentezlenmesinde zincirlerin yarısı korunmakta diğer yarısı ise yeniden sentezlenmektedir. Bu yüzden DNA sentezlenmesi olayı yarı korumalıdır (semikonservatif).

24. Replikasyon basamakları Replikasyon için ilk işlem DNA sarmallarının açılıp birbirlerinden ayrılmasıdır. DNA molekülünün üzerinde ayrılma işleminin olduğu alana replikasyon çatalı adı verilir. Bu işlem sırasında bazlar arasındaki bağlar kırılmalıdır.

26. DNA polimeraz Her bir sarmal yeni bir sarmalın sentezi için kalıp görevi görür. DNA polimeraz enzimi her bir kalıp sarmalın üzerinde bulunan nükleotidin karşısına tamamlayıcı bazı getirir. A nın karşısına T, G nin karşısına ise C gelecek şekilde bazlar eşleşir.

28. Nükleotidler Bu işlem için kullanılan nükleotidler ATP, GTP, CTP ve TTP dir. Her bir nükleotid 3 tane fosfat grubuna sahiptir. Her bir nükleotid büyüyen sarmala katıldıkça 2 fosfatı kaybeder. DNA polimeraz daima 5’ den 3’ yönüne doğrudur ve kalıp olarak da 3’ den 5’ yönündeki DNA zincirini kullanır.

29. Okazaki parçaları Bunun sonucu olarak DNA nın açılma yönündeki replikasyon çatalı üzerinde, yine açılma yönünde 3’-OH ucuna nükleotidlerin eklenmesi ile oluşan bir sürekli zincir ile diğer zinciri kalıp olarak alan ve sarmal açıldıkça yeni başlangıçlarla DNA zincir parçalarının meydana geldiği kesikli zincirler sentezlenir. Bu DNA zincir parçalarına Okazaki parçaları adı verilir bunlar daha sonra DNA ligaz enzimi ile birleştirilir. DNA helikaz enzimi DNA yı iyice açarak replikasyonun tamamlanmasını sağlar. Bu arada DNA topizomeraz enzimi de DNA nın dönmesini ve bükülmesini engeller