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Presenta varias isoformas N-p53 carece dominio N terminal 40 - PowerPoint PPT Presentation


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P-53. P-53 Se descubre en 1979 oncogen (forma mutada e inactiva ) Gen supresor de tumores Integridad genómica Control en la progresión del ciclo celular Sobrevida celular. P-53. Presenta varias isoformas N- p53 carece dominio N terminal ( 40/47kDa)

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Presentation Transcript

  • P-53

  • Se descubre en 1979 oncogen

  • (forma mutada e inactiva )

  • Gen supresor de tumores

  • Integridad genómica

  • Control en la progresión del ciclo

  • celular

  • Sobrevida celular


  • Presenta varias isoformas

  • N-p53 carece dominio N terminal

    ( 40/47kDa)

  • Actua como inhibidor dominante negativo

    de la Full Lenght p53


  • IRES ( internal ribosomal entry sites )

  • Iniciacion de la traduccion CAP

  • independiente (1988 picornavirus)

  • Union directa de subunidad ribosomal

  • 40s en un sitio interno sobre mRNA

  • Se define por su funcion

  • Tiene codon de iniciacion AUG

  • Utilizacion de factores de iniciacion

  • (ITAF )


  • IRES ( internal ribosomal entry sites )

  • Se reconoce a traves de ensayos

  • utilizando construcciones bicistronicas

  • Dos genes reporteros bajo un mismo

  • promotor ( luciferasas )

  • Entre ambos la zona de probable IRES

  • El primer reportero se va a traducir

  • utilizando la estructura CAP,luego hay STOP

  • Si encuentro el producto del segundo

  • mensajero es que esa secuencia es un IRES



Objetivo realiza a traves de dos IRES :

  • Identificacion de las secuencias IRES

  • Ubicación en la secuencia completa del gen P-53



  • Metodo realiza a traves de dos IRES : Transcripcion In Vitro

  • Plasmido monocistronico

  • GFP gen reportero ( downstream )

  • RNA polimerasa T7

  • Presencia / ausencia de analogo de CAP


Metodo
Metodo: realiza a traves de dos IRES

  • Transfecciones utilizando construcciones monocistronica

  • DNAs 5’251 y 134 nt P-53 RNAm de

    sangre de individuos sanos

  • Clonado en el vector pCDNA 3 con GPF

  • HCV – IRES - GFP


  • Al agregar analogo de CAP : realiza a traves de dos IRES

  • No inhibe la traducccion del +39

  • Inhibe parcialmente la –1

  • Si inhibe a la GFP - CAP


resultado realiza a traves de dos IRES

  • Con o sin analogo de CAP se observa traduccion

  • Estos resultados indican que el p53+39 y –1 permiten el inicio de la traduccion CAP independiente ( dos sitios IRES )


Objetivo: realiza a traves de dos IRES comprobar que el inicio de la traducción de la proteína P53, se realiza mediante IRES, en el extremo 5’ UTR.

Material y métodos: se utilizo plasmidos bicistronicos, con 2 genes reporteros Rluc y Fluc, promotor y secuencia P53 +1, P53 +39.


2da Hipótesis realiza a traves de dos IRES : descartar que las secuencias 5’UTR P53, no se

Realiza a través de la lectura ribosomal Cap dependiente.

2do plasmido denominado PrDEp53(+39) y PrDEp53(+1),

Se agrego secuencia regulatoria del virus de la encéfalo miocarditis que inhibe la traducción por CAP y un control

interno con PrDEF


Luego se descarto la traducción del 2do cistron, colocando realiza a traves de dos IRES

el EMCV Rio arriba


Resultado
resultado realiza a traves de dos IRES

La traducción de P53 (+39) y P53(+1)

se realizo a partir del IRES en la posición 5’UTR.


3ra hipótesis: realiza a traves de dos IRES descartar que la traducción mediada por

p53 (+39) es independiente de la mediada por p53 (+1).

Material y métodos: se utilizo plasmidos con construcciones

Bicistrónicas, mutando a +1 ATG por AAG.

Y un control WT p53

AAG


resultado realiza a traves de dos IRES

no se encontró cambios significativos de la actividad

Fluc, comparada con WT. Ambos genes se traducen de manera

independiente


Objetivo
objetivo realiza a traves de dos IRES

  • Descartar la posibilidad de que la actividad Fluc del ADN bicistrónico p53 (+39) sea debida a la presencia de sitios splice o promotores crípticos


Metodo1
Metodo realiza a traves de dos IRES

  • Tranfeccion:

    RNA celulas Hela transfectadas con

    plasmidos bicistronicos con ensayo con luciferasa

    Infeccion con virus vaccinia ( con promotor T7) en contrucciones eucarioticas sin promotor

  • Sincronizacion:

    Despues de 24 hs , nocodazole G2/ M o

    Timidina en fase S


Metodo2
Metodo realiza a traves de dos IRES

RT-PCR dos primers P1 3’ RLUC

P2 3’ FLUC

P3 5’ RLUC

P4 5’ FLUC

Northern blot P-53 (+39 )

P-53 (-1 )

CVB3 IRES

Control FLUC ARN


Resultado1
resultado realiza a traves de dos IRES

  • Observaron presencia de ARN bicistrónico completo y no pequeños ARN

  • Demostraron que los cistrones eran parte de una transcripción única



Metodo3
Metodo cantidades de transcriptos monocistrónicos generados por el segundo cistrón , no detectados por estos análisis de ARN

  • Transfección de células Hela con plásmido bicistrónico pBS-Rp53(+39) que carece de promotor eucariota pero tiene promotor T7

  • Demuestra la ausencia de promotores crípticos en la secuencia 5’UTR p53 que lleve a la transcripción de ARN Fluc

  • Infeccion con virus vaccinia ( T7 – ARN polimerasa )


  • En presencia del virus vaccinia fue alta la actividad de Fluc y Rluc

  • El control null negativo mostró actividad de Rluc pero es no activo sin este virus

  • El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53



  • Se investigó la actividad de los IRES que median la traducción de ΔN-p53 y de p53 completa en las diferentes fases del ciclo celular.

  • Para ello se trasfectaron células HeLa con plásmidos bicistrónicos pRp53(+39)F (regula ΔN-p53) o pRp53(-1)F (regula p53 completa)

  • Las células fueron detenidas en la transición entre la fase G2 y M con Nocodazole.


Regulaci n de ires de p53 dependiente de la fase del ciclo celular
REGULACIÓN DE IRES DE P53 DEPENDIENTE DE LA FASE DEL CICLO CELULAR

  • Se liberó el bloqueo del ciclo celular

  • Se evaluó la actividad de luciferasa en diferentes tiempos para cada uno de los vectores

  • Se evaluó el ciclo celular en diferentes tiempos mediante citometría de flujo


Resultados
RESULTADOS CELULAR

  • La actividad de luciferasa de p53(+39)IRES (regula ΔN-p53) fue máxima a las 24 hs.

  • Coincide con el mayor número de células en fase S (citometría de flujo-24 hs)

  • Sugiere que la actividad de p53(+39)IRES es máxima durante la progresión a fase S

  • El nivel de la proteina ΔN-p53 alcanza su punto máximo en fase S


Resultados1
RESULTADOS CELULAR

  • La actividad de luciferasa de p53(-1)IRES (regula p53 completa) fue máxima a las 0 hs y a las 42 hs

  • Coincide con el mayor número de células en la transición entre G2 y M (citometría de flujo-0 hs y 42 hs)

  • Sugiere que la actividad de p53(-1)IRES es máxima durante la transición entre G2 y M



Discusi n
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • La traducción mediada por IRES es un mecanismo alternativo de iniciación de la traducción del mRNA celular

  • Constituye una forma de regulación de la expresión génica bajo diferentes condiciones fisiológicas


Discusi n1
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • El gen p53 juega un rol fundamental en la progresión del ciclo celular

  • Cumple funciones de checkpoint en G1/S y G2/M

  • La isoforma N-p53 se encuentra altamente expresada en el comienzo de la Fase S

  • Puede facilitar la transición G1-S por inhibición de la actividad wild-type p53


Discusi n2
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • Este trabajo demostró que el incremento de la actividad del IRES en la transición G1-S resulta en altos niveles de N-p53

  • Esto provoca un efecto negativo sobre la actividad del gen completo de p53

  • La isoforma N-p53 es resistente a la degradación mediada por Mdm-2


Discusi n3
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • La traducción del gen completo p53 mediada por IRES, muestra una alta actividad en la transición G2-M

  • Este es un mecanismo alternativo de síntesis de proteínas

  • Sería responsable de síntesis de niveles basales de p53


Discusi n4
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • La traducción del gen completo p53 mediada por IRES es baja G2-M

  • Pequeños aumentos en la síntesis del gen completo p53 serían degradados por Mdm-2

  • Este mecanismo permite la progresión a la siguiente fase del ciclo celular


Discusi n5
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • Este trabajo propone la existencia de dos IRES que mediarían en la traducción de dos isoformas diferentes de la misma p53

  • Los autores no descartan la existencia de un solo IRES en p53 mRNA

  • La iniciación de la traducción podría darse a nivel de dos codones diferentes


Discusi n6
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • La interacción de diferentes ITAFs con IRES celulares, es un importante mecanismo de regulación de la iniciación de la traducción

  • Varias proteínas, incluída la misma p53 interactúan con el extremo 5’UTR de p53 mRNA


Discusi n7
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • La interacción de p53 con 5’UTR inhibe la traducción de p53 mRNA

  • Es una función de control autoregulatorio negativo


Discusi n8
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • La producción de p53 mRNA es alta en G1-S, pero alcanza su pico máximo en la mitad de Fase S

  • Esto sugiere que la proporción relativa de p53 y N-p53 puede ser decisiva en la regulación de la traducción de p53


Discusi n9
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • Altos niveles de N-p53 producidos en la transición G1-S por la actividad de (+39) IRES, puede prevenir la unión de full-length p53 al extremo 5’UTR

  • De esta manera se permite la producción de full-length p53 en medio de la Fase S


Discusi n10
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • La síntesis de niveles suficientes de full-length p53 que interactúa con 5’UTR del mRNA:

    - Inhibe la traducción

    - Genera un feedback negativo

    - Permite el ingreso a la fase

    G2/M del ciclo celular


Discusi n11
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • Este modelo sugiere una intrincada regulación de la expresión del gen p53 por interacciones de la proteína-RNA

  • Esto sucede para permitir la progresión normal del ciclo celular, mediante controles checkpoints de dicho ciclo ante un daño del DNA


Discusi n12
Discusión mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • Recientemente, otras dos proteínas, la proteína ribosomal L26a y la Nucleolina demostraron interactuar con p53 5’UTR, modulando así la traducción

  • Ambas proteínas también interactúan con IRESs virales


Conclusiones
Conclusiones mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes

  • Estudios futuros sobre el rol de éstas y de otras proteínas interactuantes p53-IRES podrán proveer información sobre la regulación de la expresión del gen p53 en condiciones fisiológicas y de stress


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