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Presenta varias isoformas N-p53 carece dominio N terminal 40 - PowerPoint PPT Presentation


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P-53. P-53 Se descubre en 1979 oncogen (forma mutada e inactiva ) Gen supresor de tumores Integridad genómica Control en la progresión del ciclo celular Sobrevida celular. P-53. Presenta varias isoformas N- p53 carece dominio N terminal ( 40/47kDa)

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Presentation Transcript
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P-53

  • Se descubre en 1979 oncogen
  • (forma mutada e inactiva )
  • Gen supresor de tumores
  • Integridad genómica
  • Control en la progresión del ciclo
  • celular
  • Sobrevida celular
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P-53

  • Presenta varias isoformas
  • N-p53 carece dominio N terminal

( 40/47kDa)

  • Actua como inhibidor dominante negativo

de la Full Lenght p53

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IRES ( internal ribosomal entry sites )

  • Iniciacion de la traduccion CAP
  • independiente (1988 picornavirus)
  • Union directa de subunidad ribosomal
  • 40s en un sitio interno sobre mRNA
  • Se define por su funcion
  • Tiene codon de iniciacion AUG
  • Utilizacion de factores de iniciacion
  • (ITAF )
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IRES ( internal ribosomal entry sites )

  • Se reconoce a traves de ensayos
  • utilizando construcciones bicistronicas
  • Dos genes reporteros bajo un mismo
  • promotor ( luciferasas )
  • Entre ambos la zona de probable IRES
  • El primer reportero se va a traducir
  • utilizando la estructura CAP,luego hay STOP
  • Si encuentro el producto del segundo
  • mensajero es que esa secuencia es un IRES
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Los autores proponen que la traduccion en ambas isoformas se realiza a traves de dos IRES
  • 5’ UTR para full-lenght
  • Protein coding region para N-p53
  • Con distinta actividad en el ciclo celular
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Objetivo:
  • Identificacion de las secuencias IRES
  • Ubicación en la secuencia completa del gen P-53
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MFOLD algoritmo : estructuras secundarias

  • 134 nt 5’ UTR
  • 5’ 251 nt
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Metodo : Transcripcion In Vitro
  • Plasmido monocistronico
  • GFP gen reportero ( downstream )
  • RNA polimerasa T7
  • Presencia / ausencia de analogo de CAP
metodo
Metodo:
  • Transfecciones utilizando construcciones monocistronica
  • DNAs 5’251 y 134 nt P-53 RNAm de

sangre de individuos sanos

  • Clonado en el vector pCDNA 3 con GPF
  • HCV – IRES - GFP
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Al agregar analogo de CAP :
  • No inhibe la traducccion del +39
  • Inhibe parcialmente la –1
  • Si inhibe a la GFP - CAP
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resultado

  • Con o sin analogo de CAP se observa traduccion
  • Estos resultados indican que el p53+39 y –1 permiten el inicio de la traduccion CAP independiente ( dos sitios IRES )
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Objetivo: comprobar que el inicio de la traducción de la proteína P53, se realiza mediante IRES, en el extremo 5’ UTR.

Material y métodos: se utilizo plasmidos bicistronicos, con 2 genes reporteros Rluc y Fluc, promotor y secuencia P53 +1, P53 +39.

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2da Hipótesis: descartar que las secuencias 5’UTR P53, no se

Realiza a través de la lectura ribosomal Cap dependiente.

2do plasmido denominado PrDEp53(+39) y PrDEp53(+1),

Se agrego secuencia regulatoria del virus de la encéfalo miocarditis que inhibe la traducción por CAP y un control

interno con PrDEF

resultado
resultado

La traducción de P53 (+39) y P53(+1)

se realizo a partir del IRES en la posición 5’UTR.

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3ra hipótesis:descartar que la traducción mediada por

p53 (+39) es independiente de la mediada por p53 (+1).

Material y métodos: se utilizo plasmidos con construcciones

Bicistrónicas, mutando a +1 ATG por AAG.

Y un control WT p53

AAG

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resultado

no se encontró cambios significativos de la actividad

Fluc, comparada con WT. Ambos genes se traducen de manera

independiente

objetivo
objetivo
  • Descartar la posibilidad de que la actividad Fluc del ADN bicistrónico p53 (+39) sea debida a la presencia de sitios splice o promotores crípticos
metodo1
Metodo
  • Tranfeccion:

RNA celulas Hela transfectadas con

plasmidos bicistronicos con ensayo con luciferasa

Infeccion con virus vaccinia ( con promotor T7) en contrucciones eucarioticas sin promotor

  • Sincronizacion:

Despues de 24 hs , nocodazole G2/ M o

Timidina en fase S

metodo2
Metodo

RT-PCR dos primers P1 3’ RLUC

P2 3’ FLUC

P3 5’ RLUC

P4 5’ FLUC

Northern blot P-53 (+39 )

P-53 (-1 )

CVB3 IRES

Control FLUC ARN

resultado1
resultado
  • Observaron presencia de ARN bicistrónico completo y no pequeños ARN
  • Demostraron que los cistrones eran parte de una transcripción única
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Pero hay actividad Fluc posiblemente por pequeñas cantidades de transcriptos monocistrónicos generados por el segundo cistrón , no detectados por estos análisis de ARN
metodo3
Metodo
  • Transfección de células Hela con plásmido bicistrónico pBS-Rp53(+39) que carece de promotor eucariota pero tiene promotor T7
  • Demuestra la ausencia de promotores crípticos en la secuencia 5’UTR p53 que lleve a la transcripción de ARN Fluc
  • Infeccion con virus vaccinia ( T7 – ARN polimerasa )
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En presencia del virus vaccinia fue alta la actividad de Fluc y Rluc
  • El control null negativo mostró actividad de Rluc pero es no activo sin este virus
  • El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53
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El cociente entre Fluc y Rluc del ARN bicistrónico capeado que contiene 5’UTR de p53 (+39) y (-1) se incrementa comparado con el control de ARN bicistrónico que carece de secuencias de p53
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Se investigó la actividad de los IRES que median la traducción de ΔN-p53 y de p53 completa en las diferentes fases del ciclo celular.
  • Para ello se trasfectaron células HeLa con plásmidos bicistrónicos pRp53(+39)F (regula ΔN-p53) o pRp53(-1)F (regula p53 completa)
  • Las células fueron detenidas en la transición entre la fase G2 y M con Nocodazole.
regulaci n de ires de p53 dependiente de la fase del ciclo celular
REGULACIÓN DE IRES DE P53 DEPENDIENTE DE LA FASE DEL CICLO CELULAR
  • Se liberó el bloqueo del ciclo celular
  • Se evaluó la actividad de luciferasa en diferentes tiempos para cada uno de los vectores
  • Se evaluó el ciclo celular en diferentes tiempos mediante citometría de flujo
resultados
RESULTADOS
  • La actividad de luciferasa de p53(+39)IRES (regula ΔN-p53) fue máxima a las 24 hs.
  • Coincide con el mayor número de células en fase S (citometría de flujo-24 hs)
  • Sugiere que la actividad de p53(+39)IRES es máxima durante la progresión a fase S
  • El nivel de la proteina ΔN-p53 alcanza su punto máximo en fase S
resultados1
RESULTADOS
  • La actividad de luciferasa de p53(-1)IRES (regula p53 completa) fue máxima a las 0 hs y a las 42 hs
  • Coincide con el mayor número de células en la transición entre G2 y M (citometría de flujo-0 hs y 42 hs)
  • Sugiere que la actividad de p53(-1)IRES es máxima durante la transición entre G2 y M
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El experimento se repitió bloqueando el ciclo celular en G1 mediante tratamiento con doble timidina, con resultados semejantes
discusi n
Discusión
  • La traducción mediada por IRES es un mecanismo alternativo de iniciación de la traducción del mRNA celular
  • Constituye una forma de regulación de la expresión génica bajo diferentes condiciones fisiológicas
discusi n1
Discusión
  • El gen p53 juega un rol fundamental en la progresión del ciclo celular
  • Cumple funciones de checkpoint en G1/S y G2/M
  • La isoforma N-p53 se encuentra altamente expresada en el comienzo de la Fase S
  • Puede facilitar la transición G1-S por inhibición de la actividad wild-type p53
discusi n2
Discusión
  • Este trabajo demostró que el incremento de la actividad del IRES en la transición G1-S resulta en altos niveles de N-p53
  • Esto provoca un efecto negativo sobre la actividad del gen completo de p53
  • La isoforma N-p53 es resistente a la degradación mediada por Mdm-2
discusi n3
Discusión
  • La traducción del gen completo p53 mediada por IRES, muestra una alta actividad en la transición G2-M
  • Este es un mecanismo alternativo de síntesis de proteínas
  • Sería responsable de síntesis de niveles basales de p53
discusi n4
Discusión
  • La traducción del gen completo p53 mediada por IRES es baja G2-M
  • Pequeños aumentos en la síntesis del gen completo p53 serían degradados por Mdm-2
  • Este mecanismo permite la progresión a la siguiente fase del ciclo celular
discusi n5
Discusión
  • Este trabajo propone la existencia de dos IRES que mediarían en la traducción de dos isoformas diferentes de la misma p53
  • Los autores no descartan la existencia de un solo IRES en p53 mRNA
  • La iniciación de la traducción podría darse a nivel de dos codones diferentes
discusi n6
Discusión
  • La interacción de diferentes ITAFs con IRES celulares, es un importante mecanismo de regulación de la iniciación de la traducción
  • Varias proteínas, incluída la misma p53 interactúan con el extremo 5’UTR de p53 mRNA
discusi n7
Discusión
  • La interacción de p53 con 5’UTR inhibe la traducción de p53 mRNA
  • Es una función de control autoregulatorio negativo
discusi n8
Discusión
  • La producción de p53 mRNA es alta en G1-S, pero alcanza su pico máximo en la mitad de Fase S
  • Esto sugiere que la proporción relativa de p53 y N-p53 puede ser decisiva en la regulación de la traducción de p53
discusi n9
Discusión
  • Altos niveles de N-p53 producidos en la transición G1-S por la actividad de (+39) IRES, puede prevenir la unión de full-length p53 al extremo 5’UTR
  • De esta manera se permite la producción de full-length p53 en medio de la Fase S
discusi n10
Discusión
  • La síntesis de niveles suficientes de full-length p53 que interactúa con 5’UTR del mRNA:

- Inhibe la traducción

- Genera un feedback negativo

- Permite el ingreso a la fase

G2/M del ciclo celular

discusi n11
Discusión
  • Este modelo sugiere una intrincada regulación de la expresión del gen p53 por interacciones de la proteína-RNA
  • Esto sucede para permitir la progresión normal del ciclo celular, mediante controles checkpoints de dicho ciclo ante un daño del DNA
discusi n12
Discusión
  • Recientemente, otras dos proteínas, la proteína ribosomal L26a y la Nucleolina demostraron interactuar con p53 5’UTR, modulando así la traducción
  • Ambas proteínas también interactúan con IRESs virales
conclusiones
Conclusiones
  • Estudios futuros sobre el rol de éstas y de otras proteínas interactuantes p53-IRES podrán proveer información sobre la regulación de la expresión del gen p53 en condiciones fisiológicas y de stress
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