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Vectorologie. Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes. Etienne Decroly, CNRS [email protected] Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes . Les virus constituent des systèmes d’expression spécialisés Question ?

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Presentation Transcript
Vectorologie

Vectorologie

Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes

Etienne Decroly, CNRS

[email protected]


Utilisation des syst mes viraux comme vecteurs d expression de g nes
Utilisation des systèmes viraux comme vecteurs d’expression de gènes

  • Les virus constituent des systèmes d’expression spécialisés

    Question ?

    Peut-on les utiliser pour exprimer selon nos besoins des protéines d’intérêt dans une cellule cible?

  • Oui, les virus sont à l’origine de plusieurs systèmes d’expression utilisés à ce jour

    • Thérapies génique

    • biotechnologies

Exemples :

phage display

vecteurs d’expression viraux

vaccination


Vecteurs viraux courants eucaryotes

Efficacité d’expression de gènes

Ciblage

  • Problèmes liés aux ADN nus :

Vecteurs viraux courants (eucaryotes)

  • Vecteurs réplicatifs

    • Vecteurs se répliquant de manière autonome

      • Pas d ’utilisation en thérapie génique

      • Utilisation en biologie moléculaire, cellulaire, biochimie, biotechnologie à l ’échelle industrielle, vaccinologie et expression des protéines

      • Exemples :

        Pox Virus (Vaccinia virus) : cellules mammifères, tropisme large

        Baculovirus : cellules d ’insectes, expression très élevée

        ! Vecteurs dérivés non réplicatifs en cellules mammifères

  • Vecteurs non réplicatifs

    • Les virus recombinants ne se répliquent que dans des cellules exprimant les gènes essentiels à la réplication délétés dans la construction du vecteur : « packaging cell lines »

    • Utilisation en biologie moléculaire et thérapie génique

    • Exemples :

Adénoviraux : Ad2 & Ad5

Rétroviraux : MLV, lentiviraux( HIV)

Adéno associés : famille des parvovirus

Alphavirus : SFV


Caract ristiques recherch es pour un vecteur viral th rapie g nique

Ciblage d’expression de gènes

et

Expression

Sécurité

Production

Caractéristiques recherchées pour un vecteur viral (thérapie génique)

Tropisme cellulaire adaptable (choix des enveloppes virales)

Régulation de la transcription possible (choix des promoteurs)

Stabilité d’expression (intégration ou épisomes, immunogénicité faible)

Matériel génétique inséré de grande taille (de 3 à 100kb)

Recombinaison faible voir absente

Toxicité faible (immunogénicité faible, intégration dirigée)

Réponse immunitaire faible (expression minimum de gènes viraux)

« Packaging cell lines » aisément cultivables

Production de virus à hauts titres infectieux


Comment construire un virus recombinant r plicatif
Comment construire un virus recombinant réplicatif ? d’expression de gènes

  • Identifier un gène non essentiel à la réplication, ou conditionnellement nécessaire

  • Remplacer ce gène non essentiel par le « trans gène » (TG)


Poxvirus cycle du virus de la vaccine
Poxvirus : cycle du virus de la vaccine d’expression de gènes

Virus ADN double-brin linéaire (200 kb)

  • 10% des protéines totales de la cellule sont des protéines de la vaccine

  • Cycle entièrement cytoplasmique

  • Infection de tout type cellulaire mammifère et aviaire (sauf CHO)


Construction de virus recombinants

Virus de la d’expression de gènes

vaccine

Séquences du gène TK

Transgène

  • Choix du promoteur

  • (précoce ou tardif)

pro

Promoteur Vaccine

pro

Cellules

Mammifères

MCS

5’

Infection

3’

Transfection

Recombinaison homologue

0,1 à 0,5%

Noyau

Virus de la vaccine

Recombinant (TK-/TG+)

+

virus WT (99,9%)

Construction de virus recombinants

  • Le gène codant pour la protéine tymidine Kinase (TK) n’est pas essentiel à l’infection virale dans des cellules en division

    • Principe :Introduire le TG par recombinaison homologue dans le gène TK


S lection et purification des virus recombinants
Sélection et purification des virus recombinants d’expression de gènes

  • C’est l’étape limitante :

    • Sélection des virus TK-:

      • en présence de BrdU (5-bromodéoxyuridine) , la TK phosphoryle le BrdU qui est incorporé dans le génome viral (létal)

      • sélection en incorporant un gène de résistance aux antibiotiques ou le gène lacZ (blanc bleu)

  • Purification des virus:

    • Par dilution limite (plage de lyse)

    • Plusieurs cycles nécessaires

  • Contrôle de l’expression des TG

    • PCR

    • Western Blot


Avantages et limitations du syst me vaccine
Avantages et limitations du système vaccine d’expression de gènes

  • Utilisation principale : expression de protéines en cellules mammifères

  • Constructions de virus recombinants :

    • Construction du plasmide difficile (recombinaison)

    • Choix possible du promoteur (précoce ou tardif, fort ou faible)

    • Sélection des virus recombinants et purification longues

    • Production de stocks de virus recombinants facile

  • Inconvénients

    • Les virus WT et recombinants sont infectieux et immunogène pour l ’homme (yeux)

    • Ce sont des virus infectieux… (L2 ou L3)  utiliser la souche Ankara MVA atténuée

    • La vaccine perturbe les métabolismes cellulaires :Expression des protéines endogènes 

    • Effet cytopathique : les cellules infectées meurent 48 h après infection

    • Infecte seulement les cellules en division

  • Avantages

    • Niveau d’expression élevé

    • Modifications post-traductionnelles ad-hoc (glycosylation, clivages protéolytiques)

    • Taille des inserts > 20kb

    • Production aisée de titres infectieux (1010 PFU/ml)

    • Choix du promoteur (précoce ou tardif)

    • Ancien vecteur de choix pour les vaccinations

    • Transcription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage)


Syst me vaccine t7 pol transfection infection 1

Virus de la d’expression de gènes

Vaccine (WT)

pro

T7pol

5’

3’

Infection

Cellules

Mammifères

Recombinaison homologue

0,1 à 0,5%

Transfection

Sélection et purification

de virus de la vaccine

recombinant

exprimant la T7 Pol

Noyau

Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (1)

  • Construction d’un virus de la vaccine recombinant exprimant la T7 Pol


Syst me vaccine t7 pol transfection infection 2

VV: T7 Pol d’expression de gènes

3. Infection

Transgène

pro

ARNm Protéines

MCS

Noyau

pro

TG

2. Transfection

Promoteur T7 Pol

pro

T7 polymérase exprimée par le VV

Système vaccine T7 Pol : transfection/infection (2)

Expression de gènes sous le contrôle de la T7 polymérase :

1. Construction

d’un plasmide

  • Avantages/Inconvénients

    • Expression aisée de multiples constructions

    • La transfection est une étape limitante pour les productions industrielles

    • Transcription cytoplasmique (pas de problème d ’export des ARNm, pas d ’épissage)


Baculovirus

pH d’expression de gènes dépendante

Phases tardives

Phases très tardives

Baculovirus

Virus ADN double-brin circulaire (130Kb)

Polyhédrine

nécessaire pour l’infection d’un nouvel hôte

arthropodes (lépidoptères, SF9)


Formation de baculovirus recombinants

Séquences baculovirales d’expression de gènes

polyhédrine

Baculovirus

Transgène

1. clonage

Promoteur polyhédrine

pro

3. Infection

pro

MCS

Cellules SF9, SF 21

2. Transfection

Recombinaison homologue

0,1 à 0,5%

Noyau

Baculovirus

recombinant

Formation de baculovirus recombinants

  • Particularités de la polyhédrine :

    • Niveau d ’expression très élevé (jusqu’à 50% du total cellulaire)

    • Protéines non essentielles à la propagation de l ’infection

    • Les virus recombinants ∆ polyhédrine ont une morphologie identifiable dans la cellule

    •  recombinaison homologue dans le gène de la polyhédrine.


Vecteurs baculoviraux commerciaux

99% de recombinants d’expression de gènes

Vecteurs baculoviraux commerciaux


Avantages et limitations des vecteurs baculoviraux
Avantages et limitations des vecteurs baculoviraux d’expression de gènes

  • Utilisation principale : expression de protéines en cellules d’insectes, vaccins recombinants, production de protéines insolubles en bactéries.

  • Avantages

    • Promoteur très fort, niveau d’expression élevé

    • Modifications post-traductionelles proches du système mammifère

      • Glycosylations : high-mannose mais pas hybride et complexes

      • Transport et processing ad-hoc

    • Taille des inserts > 50kb

    • Production aisée de titres infectieux (1010 PFU/ml)

    • Pas d ’infection possible de l ’homme (restriction au niveau de la transcription)

  • Inconvénients

    • Virus lytique (chez l ’insecte)

    • La formation des virus recombinants est une étape limitante


Vecteurs de deuxi me g n ration pour th rapie g nique
Vecteurs de deuxième génération pour thérapie génique d’expression de gènes

  • Le baculovirus est capable d’infecter des cellules mammifères (récepteur présent)

  • Toutefois ces gènes ne sont pas transcrits

    • L ’activation des unités transcriptionelles est restreinte aux cellules d’insectes

    •  L ’intégration d’un transgène (TG) en aval d’un promoteur eucaryote permet l ’expression du TG

  • Avantages

    • Production aisée de hauts titres infectieux

    • Tropisme large (récepteurs inconnus)

    • Pas de réplication ni de production de protéines virales chez l’hôte

    • Survie des cellules infectées (virus lytique chez l ’insecte)

    • Insert de grande taille (50 kb) et choix possible des promoteurs

    • Risque de recombinaison très faible

    • « Packaging cell lines » : pas de construction complexe (SF9)

  • Inconvénients

    • Pas d ’intégration, persistance limitée

  • Non déterminé

    • Réponse immunitaire ?

    • Infection des cellules quiescentes?

Song SU, Boyce FM.

Exp Mol Med. (2001) Mar 31;33(1):46


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