PROTEINA PRECURSORE β – AMILOIDE (APP): UNA VISIONE D’INSIEME

1. Researcharticle Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1 Tracy L Young-Pearse, Allen C Chen, Rui Chang, Cesar Marquez and Dennis J. Selkoe PROTEINA PRECURSORE β – AMILOIDE (APP): UNA VISIONE D’INSIEME Center for Neurologic Diseases, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA Published: 23 June 2008 NeuralDevelopment2008, VITO MARIA BUONOMENNA FEDERICA SARACENO

2. STRUTTURA E FUNZIONI APP • ANALISI E DATI SPERIMENTALI • ALTERAZIONIPATOLOGICHE

3. STRUTTURA & FUNZIONI

4. La proteina precursore dell’amiloide (APP) È una glicoproteina di membrana di tipo I Codificata da un gene localizzato sul braccio lungo del cromosoma 21 Identificata nel 1987

5. APP è espressa in tre isoforme costituite rispettivamente da 695, 751 e 770 amminoacidi. È localizzata sulla membrana plasmatica dei dendriti, del corpo e degli assoni sia di cellule neuronali che di quelle gliali

6. Traffico intracellulare di APP • La forma matura, dalle membrane del golgi , raggiunge la membrana celullulare (step 1) • Dalla membrana plasmatica viene internalizzata con vescicole endocitiche (step 2) • Nell’endosoma viene o reciclata e ripresentata in membrana o degradata tramite enzimi idrolitici (step 3)

7. L’APP svolge alcune funzioni come proteina intatta e ne svolge altre quando è ridotta in frammenti . Il clivaggio della proteina avviene attraverso tre specifiche proteasi , su determinate sequenze sia sul dominio intracitoplasmatico che extracellulare

8. L’enzima maggiormente coinvolto fisiologicamente nella processazione di APP è l’ α-secretasi appartenente alla famiglia ADAM ( A Disintegrin and Metallopeptidase). Tale famiglia di enzimi tagliano specifiche sequenze dell’intera glicoproteina portando al rilascio di un frammento extracellulare che prende Il nome di frammento α della proteina amiloidea (APPα)

9. Le α-secretasi non sono gli unici enzimi che possono mediare il clivaggio di APP , anche le β-secretasi e le γ-secretasi hanno la medesima funzione. Il taglio effettuato da quest’ultimo enzima porta alla formazione di frammenti amiloidogenici coinvolti nell’eziogenesi di alcune patologie tra cui le sindromi di Alzheimer ( AD)

10. APP e i neuroni APP e APPα hanno un ruolo centrale nel controllo della crescita neuronale. Numerosi esperimenti dimostrano che la lunghezza del neurite dipende da un fine equilibrio tra APP ed il suo frammento. La proteina integra inibisce l’eccessiva crescita dell’assone mentre APPs α si oppone all’attività di APP

11. APPe l’integrinaβ1 La proteina precursore dell’amiloide puà regolare la crescita assonale tramite l’integrazione con un’integrina di membrana . L’Itg 1 attiva una cascata di segnali intracellulari che aumentano la crescita del neurite .

12. APPs-α può competere con APP impedendo il legame con l’integrinaβ1 e quindi favorendo la crescita dell’assone La funzione di APP è quella di inibire l’attività dell’integrina tramite un’ interazione omotipica attraverso uno specifico dominio di legame (NPXY).

13. L’interazione tra APP e l’integrinaβ1 è mediata da una proteina adattarice Fe65 che trasporta il dominio AICD nel nucleo, il quale regola la trascrizione genica di molecole per il citoscheletro, con implicazione nella crescita assonale APP Fe65 AICD

14. ANALISI & DATI SPERIMENTALI

15. Cellule corticali di topi knock out per APP presentano assoni più lunghi

16. smallharpin RNA (shRNA) sono sequenze di RNA che, curvandosi, formano una struttura che ricorda una forcina. Vengono solitamente utilizzati per il silenziamento dell'espressione genica attraverso l'attivazione della RNA interference.

17. Nell’immagine E è mostrata l’elettroporazione in vivo di neuroni trasfettati sia con GFP che con shRNA. Nell’immagine F è mostrata l’elettroporazione in vivo di neuroni di controllo trasfettati con GFP

18. Per dimostrare il legame tra APP e Itgβ1 è stato utilizzata l’immunoprecipitazione .

19. ALTERAZIONI PATOLOGICHE • Formazione di fibrille di amiloide • Apoptosi e stress ossidativo • Processi infiammatori

20. La sintesi e l’accumulo di frammenti del peptide Aβ nella matrice extracellulare in specifiche aree encefaliche porta alla formazione delle cosiddette placche senili: formazioni di fibrille amiloidee costituite da aggregati del peptide Aβ disposti in foglietti pieghettati con disposizione antiparallela Fibrille di amiloide sono state osservate anche disposte intorno ai capillari cerebrali disponendosi in una caratteristica struttura granulare.

21. Placcheneurofibrillari Placche senili Placche senili disposte intorno a capillari. (Fissate con blu di toluidina)

22. Il core delle placche senili risulta essere estremamente resistente a proteolisi di potenti caotropici. In queste strutture sono presenti frammenti Aβ, che costituiscono circa il 50-60% di questi ammassi fibrillari; sono presenti inoltre glicoproteine e glicolipi che rendono ulteriormente insolubili queste strutture. Oltre alla stabilità intrinseca di Aβ N-42, l’accumulo di dimeri e tetrameri incorporati essi stessi in filamenti di β amiloide aumenta la resistenza alla degradazione proteolitica. Inoltre la presenza di modifiche post-trasduzionali (isomerizzazione, ciclizzazione ed ossidazione) contribuisce all’aumento dell’insolubilità. .

23. α-secretasi • β-secretasi • γ-secretasi Gli enzimi coinvolti nel taglio proteolitico della proteina di membrana APP sono:

24. La β-Secretasi, dettaanche BACE1 (β-site of APP cleaving enzyme) o memapsina-2, è unaaspartatoproteasiacidaimportantenellapatogenesidell’AD. É unaproteinatrasmembranacodificatadal h11q23.3 sulcromosoma 11. BACE vienecodificataancheda un secondo gene presentesulcromosoma 21 (BACE2) implicatoprobabilmentenellasindromedi Down. BACE1 è unaproteinadimembranaespressasia in cellule neuronalichegliali. È localizzataprevalentementenell’E.R. e nel trans-Golgi, come pro-enzima. La suaattivazioneavvienemediantefosforilazione e attraversoiltrafficointracellulare raggiunge la membranaplasmatica dove esplica la funzionemaggiormente nota, iltaglioproteoliticodi APP suspecificiamminoacidi (Asp+1 – Glu+11) formando il frammento solubile β-42 ed il C-99 BACE

25. È stato dimostrato come l’enzima maggiormente coinvolto nella produzione del peptide β-42 sia proprio BACE1. BACE 1 sicuramente presenta altri target oltre APP, ma l’individuazione dei ruoli fisiologici di BACE1 è ancora in certa. Sicuramente in soggetti affetti da AD l’espressione di questo enzima aumenta notevolmente. Un ipotesi plausibile di tale espressione potrebbe consistere in: Mancata clearence Processi infiammatori cronici Attività di base di BACE1 Quantità minime di β39-42 Accumulo β-42 Placche senili & fibrille di amiloide Aumento dell’espressione

26. Γ-secretasi è un complesso proteolitico costituito da quattro proteine di membrana (Presenil, Nicastrin, APH-1, PEN2 ) la prima sembra presentare attività enzimatica. Se per BACE1 l’attività enzimatica ed il suo contributo nella patogenesi di placche di amiloide non è ancora del tutto chiara , nonostante l’enorme interesse che essa suscita, a maggior ragione l’attività ed i pathway del complesso di γ-secretasi sono ancora “oscuri”. Sicuramente essa agisce secondariamente agli altri due enzimi precedenti ed è coinvolta nel taglio del frammento C99, rilasciando un breve frammento membranario ed un frammento intracellulare, cosiddetto NICD (NotchIntraCellular Domain ). Tale frammento, attraverso il pathway di segnalazione di Notch, attiva programmi di trascrizione genica. Mutazioni a caricodel gene della presenilin 1 sembrano causare forme ereditarie di Sindrome di Alzheimer (FAD)

27. Amiloide e morte cellulare Aβ42 (12.5 μg/ml), 3.91% apoptotiche; 39.3 necrotiche Cellule IMR32 senza trattamento Cellule in coltura con frammenti Aβ41-42 rilasciano 4-hydroxynonenal (HNE), Cellule in coltura con frammenti Aβ41-42 rilasciano h202 TatsuoYamadaet al. ExperimentalNeurology 196 (2005) (50 μg/ml), apoptotic, necrotic, 55.32%, 26.75%, Elena Tamagnoet al. Free Radical Biology & Medicine, Vol. 35, 2003

28. Quali segnali sono coinvolti? H2O2 HNE etc A β 40-42 Fas L Fas FADD SAPK JNK3 DISC Caspase 8 c - Jun Fos APOPTOSI AP1 L Fas

29. Il peptide Aβ42 , citochine pro-infiammatorie e ROS, ad alte concentrazione, possono indurre stress ossidativo e attraverso le SAPKs (Stress ActivatedProteinKinase, attivare il pathway di JNK3/c-Jun. JNK3/c-Jun determina il reclutamento di regolatori della trascrizione genica che inducono un aumento dell’espressione di FasLigand. Tale proteina legandosi al recettore Fas attiva la via “estrinseca” di morte programmata formando il complesso DISC (death-inducingsignalingcomplex) che attiva la caspasi 8 e l’inizio della cascata pro apoptotica.1 1Amyloid Induces Neuronal Apoptosis Via a Mechanism that Involves the c-Jun N-Terminal Kinase Pathway and the Induction of FasLigand. YoshiyukiMorishimaet al. The Journal of Neuroscience, October 1, 2001, 21(19):7551–7560

30. Le patologie neurodegenerative sono associate ad unarispostaimmunitariainnataconsistentenell’attivazionedelle cellule dellamicroglia. Il peptide Aβ può interagire direttamente con i recettori delle cellule della microglia, tra cui RAGE (ReceptorforAvandedGlycation End product), scavengerreceptor CD36 . Il peptide Aβ può interagire anche con componenti del complemento. L’attivazione della microglia comporta il rilascio di fattori solubili , induzione della chemotassi, della clearence e della degradazione dei frammenti di Aβ PROCESSI INFIAMMATORI

31. Reclutamento microglia Attivazione fagocitosi Rilascio citochine pro- infiammatorie Degradazione β- amiloide Studi su topi transgenici per PS1-APP hanno dimostrato come l’aumento della vita media delle cellulle della microglia porti ad una progressiva riduzione dell’espressione di scavengerreceptor, CD 36, RAGE ed enzimi di degradazione. Altresì rimane inalterata l’espressione di molecole pro – infiammatorie

32. … Inoltre PGE2 stimola la produzione del peptide Aβ.L’interazione tra PGE2 ed i suoi recettori EP2 ed EP4 comporta l’ internalizzazione di PS-1 e la co-localizzazione con gli stessi recettori , che portano ad un aumento di PKA e cAMP che sembrano agire sulla stessa subunità catalitica della γ-secretasi aumentando la produzione del peptide Aβ e indirettamente l’espressione di geni coinvolti nella sua produzione.

33. Cellule della microglia e asctrociti, In risposta alle placche di amiloide, producono numerose componenti della cascata del complemento. L’attivazione del complemento sembra avere un ruolo protettivo nei confronti della β–amiloide. In modelli di topo APP transgenici è stata osservata la sovraespressione di sCrry che inibisce la formazione delle C3 convertasi. sCrry è una proteina regolatrice del complemento roditori specifica. Nell’uomo presenta due proteine omologhe : La proteina cofatorriale di membrana (MCP) ed il fattore accelerante il degrado (DAF)

34. In conclusione… La sintesi di frammenti di Aβ sembra essere un evento fisiologico coinvolto nei fenomeni di aging. L’accumulo di tali frammenti nella matrice extracellulare ed una progressiva diminuzione dell’attività della microglia porta alla formazione di placche di amiloide e placche senili, che per le loro caratteristiche chimico – fisiche risultano essere insolubili, difficili da fagocitare e tossiche per le cellule neuronali. In questo contesto sembra avere un ruolo chiave la microglia, in quanto generalmente è responsabile della clearence di frammenti di Aβ. Quando l’ attività viene alterata, essa induce, attraverso il rilascio di molecole pro – infiammatorie, un processo infiammatorio cronico che aggrava e accelera il processo neurodegenerativo

35. GRAZIE PER L’ATTENZIONE References RegulationofAmyloid-ProteinPrecursorbyPhosphorylationand ProteinInteractions, - Suzuki et al. the journal of biological chemistry. 2008 Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrinbeta1-Selkoe D. et al. Neuronal Development 2008, The -Secretase Enzyme BACE in Health and Alzheimer’s Disease: Regulation, Cell Biology, Function, and Therapeutic Potential-Vassar R. et al. - The Journal of Neuroscience, 2009 TowardStructuralElucidationofthe g-SecretaseComplex - Selkoe D. et al. Structure. 2009 Multiple signaling events in amyloid -induced, oxidative stress-dependentneuronalapoptosis - Tamagno E. et al. Free Radical Biology & Medicine.2003 -Amyloid Induces Neuronal Apoptosis Via a Mechanism that Involves the c-Jun N-Terminal Kinase Pathway and the Induction of FasLigand – Morishimaet al. The Journal of Neuroscience, 2001, The amyloid precursor protein intracellular domain (AICD) as modulator of gene expression, apoptosis, and cytoskeletal dynamics—Relevance for Alzheimer’s disease - Muller T. et al. Progress in Neurobiology, 2008 S