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ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici PowerPoint PPT Presentation


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ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici. ESAME CITOLOGICO : esame su versamento interstiziale esame su urine esame su striscio vaginale agoaspirato.

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ESAME ISTOLOGICO : esame estemporaneo mediante uso del criostato biopsie mirate su tessuti e\o su organi prelievi autoptici

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Presentation Transcript


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ESAME ISTOLOGICO :

esame estemporaneo mediante uso del criostato

biopsie mirate su tessuti e\o su organi

prelievi autoptici

ESAME CITOLOGICO :

esame su versamento interstiziale

esame su urine

esame su striscio vaginale

agoaspirato

ITER DI PROCEDURA NEL LABORATORIO DI ANATOMIA PATOLOGICA

  • 1FASEPROPEDEUTICA

  • 2FASEPROPEDEUTICA DI LABORATORIO

  • 3FASEPRE-ANALITICA

  • 4FASEANALITICA

  • 5FASEPOST-ANALITICA

  • 6FASEINTERPRETATIVA

  • 7REFERTAZIONE


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ISTOLOGIA :

richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno

allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame

contestuale invio di reperto anatomico o istologico (vetrini di consulenza)

esecuzione autopsia e relativi prelievi effettuata dal medico anatomo-patologo

CITOLOGIA :

richiesta esame da reparto o divisione ospedaliera interna o da medico esterno

allegate notizie cliniche e patologiche circa la motivazione della richiesta di esame

contestuale invio di campione citologico o di vetrino con striscio vaginale già eseguito dal ginecologo

(preparazione ed anamnesi del paziente sottoposto ad agoaspirato in apposito ambulatorio)

1FASEPROPEDEUTICA


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ISTOLOGIA :

ricezione biopsie e reperti

classificazione e numerazione reperti su apposito registro interno annuale progressivo

compilazione apposito modulo di profilo mirato

riduzione reperti anatomici ad opera del medico in apposite cassettine per istologia

procedura di fissazione dei tessuti in processatore automatico (autotecnico) (circa 15 h.)

(accensione e preparazione del criostato negli esami estemporanei)

2FASE PROPEDEUTICA DI LABORATORIO


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ISTOLOGIA :

inclusione in paraffina dei reperti in precedenza fissati

preparazione microtomo e bagno termostatato stendi-sezioni

raccolta sezioni istologiche di circa 3 µ su vetrini; loro fissazione in stufa a secco termostatata; procedimento deparaffinazione in solventi

(per esame al criostato : riduzione reperto e taglio sezioni con loro immediata fissazione in metanolo)

3FASEPRE - ANALITICA


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ISTOLOGIA :

colorazione manuale o automatizzata delle sezioni su vetrino

colorazione di routine E.-E.

colorazioni speciali

reazioni specifiche di immuno-isto-chimica

montaggio vetrini in mezzo di inclusione idoneo

(colorazione esame criostato)

Controllo di qualità :

uso di sezioni già risultate positive in qualità di controllo positivo

controlli inter-laboratorio

4FASEANALITICA


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ISTOLOGIA :

apposizione etichette identificative sui vetrini contenenti le sezioni colorate

archiviazione in apposite rastrelliere delle cassettine per istologia contenenti le inclusioni in paraffina

consegna dei vassoi contenenti i vetrini e dei moduli di profilo mirato al medico anatomo-patologo specialista

archiviazione dei vetrini diagnosticati in istoteche

5FASEPOST - ANALITICA


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ISTOLOGIA :

osservazione dei vetrini al microscopio ottico

interpretazione e diagnosi da parte del medico anatomo-patologo specialista

refertazione su apposito modulo di profilo mirato e relativa consegna in segreteria amministrativa

Controllo di qualità :

lettura vetrini incrociata tra medico lettore e medico revisore

lettura alla cieca inter-laboratorio

6FASEINTERPRETATIVA


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7REFERTAZIONE

  • refertazione su apposito modulo in segreteria amministrativa

  • archiviazione documentazione cartacea

  • inserimento su personal computer del referto in archivio informatico dedicato per singola area di interesse (istologia; citologia; immunopatologia)

  • archiviazione documentazione informatica

  • consegna del referto dalla segreteria al reparto o al medico richiedente o al paziente


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DOPO IL PRELIEVO

  • -Tessuti Freschi inviati direttamente al patologo: perché e come.

  • -Tessuti sotto vuoto

  • Banche di tessuti: perché e come. Problemi connessi.


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FISSAZIONE DEI TESSUTI

  • La diagnosi istopatologica, che si basa sullo studio della morfologia, richiede l’ uso di fissativi idonei a preservare nello statu quo ante migliore possibile la struttura del campione. La fissazione di un tessuto fornisce quindi una immagine statica, la quale, benché non ne rappresenti proprio le caratteristiche dell’ aspetto in vivo, deve tuttavia essere costantemente riproducibile.

    Requisiti fondamentali del fissativo ideale :

  • sicura preservazione della morfologia di base

  • integrità della struttura antigenica

  • impedimento di alterazioni biochimiche nei tessuti, per aggiunta o sottrazione di componenti chimiche

  • opposizione ai processi autolitici e putrefattivi.


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Fissazione

Definizione

Trattamento chimico che porta alla immobilizzazione e alla

stabilizzazione di componenti tessutali con minima

dislocazione ed estrazione dei composti nativi

La FORMA delle cellule e dei tessuti deve venir conservata il più possibile simile alla condizione vitale


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Fissazione

  • Una fissazione ideale prevede:

  • Stabilizzazione contro modificazioni successive indotte da trattamenti susseguenti quale l’inclusione in paraffina

  • Simultaneità nel campione della reazione tessuto-fissativo ( rapida penetrazione e diffusione nei tessuti )

  • Riproducibilità del processo di fissazione nonostante differente composizione del tessuto

  • Assenza di “anormali” componenti prodotti o estrazione di componenti native

  • Rapidità di azione ( per evitare l’insorgere di autolisi )

  • Assenza di “sovra-fissazione”


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Fissazione dei Tessuti

  • Molto importante è lo spessore del campione di tessuto che non deve, in genere, superare i 3 mm, onde evitare che al centro del tessuto intervengano fenomeni degenerativi prima dell’arrivo del fissativo.

  • Una buona fissazione, atto preliminare più importante della tecnica istologica, pena la perdita irreparabile del tessuto dipende:

  • - dal tipo, dal pH e dalla concentrazione del fissativo usato, - dalla osmolarità e dalle forze ioniche in atto

  • - dalla temperatura e dalla durata dell’intera operazione

  • In genere i fissativi più usati intervengono sulle proteine e sui lipidi, mentre i glicidi, specie se a basso peso molecolare, vengono solo inclusi tra le proteine fissate e possono diffondere nell’acqua.


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Fissazione

Classificazione

I fissativi si dividono in due classi a seconda che agiscano per:

1) Coagulazione: denaturazione irreversibile delle proteine, con

nuove stabilizzazioni tra gruppi diversi di diverse proteine

che reagiscono una con l’altra formando aggregati

MODIFICANO in modo irreversibile la struttura terziaria

3 Modi:  movimento termico con distruzione della struttura

secondaria e terziaria (calore)

 repulsione elettrostatica tra parti diverse di una stessa proteina (acidi forti, sali di metallo)

 rimozione di H2O con disidratazione (etanolo)

La disidratazione con etanolo può seguire la fissazione per

Cross-link


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Fissazione

2) CROSS LINKING: ovvero la formazione di legami crociati tra

polipeptidi all’interno di una stessa proteina o tra proteine

vicine

STABILIZZANO la conformazione nativa della proteina

E’ un processo ADDITIVO, più o meno sensibile

Tipico di ALDEIDI, CARBODIMIDE

Utile anche in ME, Istochimica


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FISSAZIONE DEI TESSUTI

Tecniche di fissazione :

  • per immersione, consistente nel sommergere il tessuto nel liquido fissativo, con rapporto volumetrico minimo tra fissativo e campione di 10 : 1

  • per perfusione, in assoluto la migliore da un punto di vista teorico - pratico, ma limitata all’ animale da esperimento o ad organi asportati in loco e con vasi integri

  • per uso di vapori, secondo cui i tessuti si fissano grazie ai vapori che si liberano da una soluzione fissativa riscaldata, permettendo così una fissazione in situ (si evita in tal modo che alcune sostanze solubili possano diffondere in soluzione e disperdersi). Si usano fissativi altamente volatili come : formaldeide, glutaraldeide, acido osmico.


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Fissazione dei Tessuti

  • La Formalina:

  • E’ il più diffuso ed usato fissativo in istopatologia, ad un valore di pH prossimo a 7.0. La formalina diviene monomerica ed idratata, una molecola di basso peso molecolare capace di penetrate rapidamente nei tessuti, con la formazione di gruppi idrossi-metile con le proteine, e con la formazione di legami di tipo metilenico tra catene polipeptidiche (cross-linking)

  • Formalina al 10%: formaldeide polimerizzata in soluzione

  • acquosa satura al 40% e successivamente diluita 1:10

  • (detta anche formaldeide 4%)

  • Formalina salata: 100 ml di formaldeide al 40% + 9 g di NaCl +

  • 900 ml di H20; è una soluzione isotonica che impedisce la

  • coartazione ed il rigonfiamento cellulare

  • Formalina nel tamponata: 100 ml di formaldeide 40% + 900 ml

  • di H20 + 4 g di fosfato acido di sodio + 6.5 g di fosfato disodico

  • anidro; impedisce l’acidificazione dei tessuti (fenomeno dovuto

  • alla trasformazione della formaldeide in acido formico),

  • mantenendo il pH a 7.0.


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Modi di Applicazione ( 1 )

  • Immersione

  • Il campione deve essere immerso in almeno

  • 20 volte volume di fissativo

  • Ottima fissazione se:

  • dimensioni adeguate (< 3 mm di spessore)

  • minimo intervallo tra asportazione e immersione

  • (< 30 m ottimale) ( le cellule, tolte dall’organismo, non sono più ossigenate e muoiono in un tempo variabile)


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Modi di Applicazione

Immersione

Importante il tipo di contenitore ( a bocca larga )

e le dimensioni.

Importanti le indicazioni sul recipiente

(non sul coperchio)

Nome, data, Numero; provenienza


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Modi di Applicazione ( 2 )

  • Perfusione a circolazione chiusa in forma liquida (aldeidi)

  • Distanza tra vasi e cellule: max. 100 microns

  • Diffusione: penetrazione del fissativo e raggiungimento della adeguata concentrazione nel tessuto.

  • Dipende da: rapporto di diffusione del fissativo che a sua volta dipende da:

  • Concentrazione

  • Temperatura

  • Natura dl fissativo

  • Topografia del tessuto in rapporto al fissativo

  • Tipo di tessuto

  • Cross Link o coagulazione


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Modi di Applicazione ( 3 )

Esposizione di cellule e tessuti disidratati (liofilizzati) a fissativi in forma gassosa (aldeidi) ad elevata temperatura ( 80°c )

Usata solo per applicazioni particolari in istochimica per rivelare amine biogene ( noradrenalina, serotonina, dopamina)


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Fissazione dei Tessuti

  • Fissativi alcolici

  • Alcool etilico 95°

  • Alcool etilico 95° ed etere etilico anaparti

  • Alcool metilico

  • Alcool metilico ed acetone anaparti

  • L’alcool di per sé, per il basso potenziale di ossidazione e per la moderata capacità di penetrazione, non è un buon fissativo per istologia ( ma è meglio di niente ); determina eccessiva coartazione ed indurimento dei tessuti, denatura le proteine e coagula grossolanamente il citoplasma; pertanto si preferisce utilizzarlo in associazione con altre componenti onde ottenere un fissativo più efficace ed omogeneo.

  • Si è soliti ricorrere all’alcool etilico 95° o all’alcool etilico 50° in egual volume al materiale prelevato come prefissaggio in citologia.


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Fissazione dei Tessuti

  • Miscele fissatrici a base di alcool:

  • Liquido di Serra: composto da 2 parti di alcool etilico 95° ed 1 parte di formaldeide 40% cui si aggiungono poche gocce di acido acetico glaciale

  • Liquido di Carnoy: costituito da 6 parti di alcool etilico 99°, 3 parti di cloroformio ed 1 parte di acido acetico glaciale

  • Liquido di Clarke: composto da 3 parti di alcool etilico 99° ed 1 parte di acido acetico glaciale

  • Formalina alcoolica di Lillie: costituita da 9 parti

  • di alcool etilico 99° ed 1 parte di formaldeide 40%


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Fissazione dei Tessuti

  • Miscele fissatrici a base di acido picrico:

  • Liquido di Bouin: composto dalla miscela di 15 parti di

  • acido picrico in soluzione satura acquosa, 5 parti di

  • formaldeide 40% ed 1 parte di acido acetico glaciale

  • Liquido di Duboscq - Brasil: costituito da 150 ml di alcool

  • etilico 80°, 60 ml di formaldeide 40%, 15 ml di acido

  • acetico glaciale ed 1 g di acido picrico

  • Entrambi sono fissativi molto penetranti; tuttavia, la presenza dell’acido picrico e di quello acetico è di ostacolo

  • ad eventuali indagini retrospettive e di estrazione del DNA e, inoltre, scioglie facilmente la maggior parte delle calcificazioni presenti.


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Rischi e precauzioni d’uso per i fissativi

  • Formaldeide : Potenziale allergenico (cancerogenicità) per inalazione e contatto.

  • Uso di cappe aspiranti.

  • Alcool : Rischio incendi

  • Glutaraldeide

  • Ac. Picrico

  • Sali di Mercurio

  • Tetrossido di Osmio

  • Importante: uso di armadi dedicati e quantità limitate.


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Tempi d’uso per i fissativi

  • Formaldeide 4% (= Formalina 10% )

  • Velocità di penetrazione = 0,5 cm in 24

  • Fissazione: Tempo varia a sec. delle dim. del frammento, da 3h a 24h

  • Alcool etilico 95% : penetra lentamente nei tessuti freschi

  • Fissazione: accettabile sono in cell. isolate e frammenti piccoli ( diam 1-2 mm)


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INCLUSIONE DEI TESSUTI

Tecnica di inclusione in paraffina :

  • Si effettua di routine su campioni privi di problemi particolari, tenendo presente che, con essa, si rendono solubili e si asportano dai tessuti i grassi.

  • La paraffina (a punto di fusione di 58 - 60 °C) è chimicamente inattiva e conserva bene i tessuti che devono essere disidratati con immersione in alcool etilico (70°, 95° 99°) e diafanizzati con solventi della paraffina (cloroformio, benzene, toluene, xilene) prima di venire impregnati in essa e successivamente inclusi in blocchetti.

  • In genere, il processo di inclusione avviene mediante l’ uso di inclusoriautomatici, fatti funzionare in ore notturne, e di dispensatori di paraffina, utilizzati per ottenere dei blocchetti ben compatti che contengono il tessuto pronto per essere sezionato con gli appositi microtomi.


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Disidratazione

ETANOLO

METANOLO

ACETONE

PROPANEDIOLO

Chiarificazione

XILOLO

BENZOLO

CLOROFORMIO


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Inclusione

Paraffina

Gelatina / Agar

Celloidina

Resine

  • Idrosolubili

  • (Metacrilati)

  • Epossidiche


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METODO IDEALE

FREON

ISOPENTANO

Congelamento dei tessuti

  • Sostanze “Protettive”

  • Glicerolo / DMSO

  • Effetti del congelamento

  • Metodi di congelamento

  • Blocchi di metallo

  • Produzione di “Neve CO2”

  • Ghiaccio secco

  • Appar. Termo-elettrici

  • Gas liquidi (N2)

Conservazione di tessuti e cellule


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METODI RAPIDI

MetodoT (°C) Efficienza

a

Fluido organico

In gas liquido

(N2)

Il più veloce

- 196

Tessuti

in liquidi

refrigerati

a

Fluido organico

In ghiaccio secco

Liquido organico

Ottimale per la

maggior parte delle

applicazioni in M.O

- 79

b

Raffreddamento

Termo-elettrico

Tessuti

in contatto di

metalli

refrigerati

- 40

scarsa

Supporto metallico

Raffreddato per

conduzione

scarsa

- 30

a: N-esano, isopentano, miscele di butano e pentano

b: giaccio secco in miscela con etanolo, metanolo o acetone


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Sezionamento

  • Microtomo

  • Criostato

  • Ultra-microtomiaM.E.

  • Temp. ideali per i vari

  • tipi di tessuto

  • Lama

  • Tratt. delle sezioni

  • 1) Essicamento (+ fissazione)

  • 2) Freeze drying o altri metodi

Rischio ambientale


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Freeze – Drying

(Liofilizzazione)

  • Principi

  • Applicazione ai tessuti

  • Trattamento successivo

  • Condiz. di congelamento

  • Condiz. di liofilizzazione

  • Temp. Tempo

  • Trappola di N2O

Inclusione in paraffina

Fissazione in vapori

Freeze – Sobstitution


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Tecnica di preparazione delle sezioni in paraffina, di circa 3 µ, per essere colorate :

E’ un procedimento atto ad assicurare che la paraffina, non miscibile con acqua ed alcool, venga eliminata ed il tessuto possa essere impregnato dal colorante. Quindi è necessario utilizzare dei solventi della paraffina ed idratare gradualmente il tessuto sino all’ H2O distillata. Nel caso in cui il colorante sia in soluzione alcoolica ci si arresta all’ alcool 95°.

xilolo5 ’

xilolo5 ’

xilolo5 ’

etanolo 100°5 ’

etanolo 100°5 ’

etanolo 100°5 ’

etanolo 95°5 ’

etanolo 70°5 ’

etanolo 50°5 ’

H2O distillata ––›

––›colorazione

SPARAFFINATURA DELLE SEZIONI


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  • Composizione(Gruppi reattivi –SO4 / = PO4 / - COOH / - O / - S/ -NH3)

  • Tipo di colorante / pH / Solventi / Additivi

  • Tipo di legame

Colorazione dei tessuti

  • Ionico (Salino – elettrostatico)

  • Covalenti (tra non metalli = elettroni

  • condivisi tra due atomi)

  • Complessi es. gruppi aldeidici R. Schiff

  • (atomo centrale con 1 o 2 legami)

  • es Ag. Diammina

  • Intermolecolari (van der Waal)

tra colorante e tessuto


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Colorazione dei tessuti

  • Colorazione di macromolecole sulla base di cariche (ioniche)

  • Componenti tissutali

  • Coloranti

  • Basofile

  • Acidofile

  • Neutrofile

  • Cationici (basici)

  • Anionici (acidi)


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COLORANTI : DEFINIZIONE

CROMOGENO ( Luce visibile 400-800 mm)

Criteri di purezzaSpettro

Gruppi cromofori

-N  -Nazoc=calkene

N = O nitrosoc=ooxo

N - O2nitro(gruppi auxocromi)

es: -SH

NOMENCLATURAcoloranti

NITRO

AZO

CHINONICI


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Pratica di colorazione dei tessuti

Technical quality

Purified / Pure / Very pure

Analytical grade

Reattivi Purezza

Acqua

Etichetta sui reattivi

Conservazione

Scarto /Scaricamento


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Coloranti

(Assorbimento colore osservato)

Coloranti cationiciNuclei / Batteri

pH 3-4 per la completa ionizzazione di gruppi di fosfato DNA / RNA (selettivo)

es. col. GRAM

Effetto di diversi fissativi / Concentrazione di sali

ZIEL-NIELSEN

+ Cresyl-violetto + I2

- col. Rosso = Fucsina


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progressive- Differenziazione

Ematossiline

regressive- pH

COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)

  • EMATEINAossidazione di ematossilina

  • Compl. con AL EMALLUME(Mayer - Carazzi)

  • Fe EMAT. HARRIS - Lillie


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Colorazione dei tessuti

Deboli

Medi

Forti

H2O2 / I2

Ac. Perform.

Permanganato

  • Ossidazione -Ossidanti

  • Riduzione

  • Acilazione / Alchilazione (form. di derivati acidi)

  • Saponificazione (idrolisi di derivati acidi

  • Deaminazione

Reazione di Blocco


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sezioni in H2O distillata

Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’

lavare H2O di fonte 10’

soluzione satura Li2CO3 15”

lavare H2O di fonte 10’

Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH3COOH1’

lavare in H2O distillata2’

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE DI ROUTINE IN ISTOLOGIA Ematossilina - Eosina

Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma rosso


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Colorazione con coloranti basici

La colorabilità dipende da vari fattori:

  • pH

  • disidratazione

  • fissazione

  • temperatura


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Colorazione con coloranti basici

  • pH della soluzione

  • Tipo di colorante

  • Tempo e temperatura

  • Tampone

  • Trattamento dopola colorazione

Dipende da:

  • Aggregati di coloranti legati a gruppi acidi

  • Legame ionico + f. van der Waal es. Blu di Toluidina

Meccanismo:

+

-

Visibile

U.V.

Alcool

resist.

Metacromasia


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PAS

HCOH

HCOH

HC

HC

O


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sezioni in H2O distillata

soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH3COOH 3 %] 30 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN BLU pH 2.5”

Risultati : nucleo rosso intenso; glico - proteine acide blu - verde; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue


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sezioni in H2O distillata

alcune sezioni possono essere pre-trattate con -amilasi (diastasi) [0.1 % in PBS] a 37 °C 30 ’

HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’

lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’

lavare in H2O di fonte 15’

contrasto nucleare con emallume 5 ’

lavare in H2O di fonte 15 ’

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PAS (acido periodico di Schiff) e PAS Diastasi”

Risultati : nucleo blu scuro; glicogeno e glico-proteine neutre rosso magenta. Dopo pretrattamento con diastasi il glicogeno non si colora


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sezioni in H2O distillata

soluzione Alcian blu 8 GX [1% in CH3COOH 3 %] 30 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

HIO4 (acido periodico) [0.5 - 1 % in H2O distillata] 15 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

reattivo di Schiff (fucsina solforosa) 45 - 60 ’

lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2 ’

lavare in H2O distillata 10’

contrasto nucleare con ematossilina Carazzi 5 ’

lavare in H2O di fonte 15 ’

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ALCIAN - PAS (VIALLI)”

Risultati : nucleo blu scuro; glico - proteine acide blu - verde; glico - proteine, glicogeno e sostanze PAS+ rosso - magenta; collagene rosso; colorazione citoplasmatica di fondo rosa tenue; altre strutture giallo


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sezioni in H2O distillata

immergere in alcool isopropilico 60 % 5’

soluzione di Oil Red O [0,5 % in 200 ml di alcool

isopropilico 100°] agitata a caldo e filtrata 20’

differenziare in alcool isopropilico 60° 20”

lavare in H2O di fonte 5’

eventuale colorazione nucleare con ematossilina 5’

lavare in H2O di fonte 10’

montare in glicerina e lutare

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DELL’ OIL RED O x I LIPIDI”

Risultati : lipidi neutri ed esteri di colesterolo rosso; fosfolipidi rosa pallido; nuclei blu - scuro


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sezioni in H2O distillata

immergere in alcool etilico 55 ° 5’

soluzione satura di Sudan nero B in alcool etilico 55 ° 40’

differenziare in alcool etilico 55° 20”

lavare in H2O di fonte 5’

montare in glicerina e lutare

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN NERO B x I LIPIDI”

Risultati : lipidi neutri blu - nero; con tale metodo si colorano anche gli steridi, gli acidi grassi, i fosfolipidi e i glicolipidi. I nuclei ed i proteoglicani acidi si colorano in bruno, tuttavia ben differenziato dal colore dei lipidi


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sezioni in H2O distillata

immergere in alcool etilico 70 ° 5’

soluzione satura in parti eguali di Sudan III e IV miscelata in alcool etilico 70 ° ed acetone in parti eguali 10’

differenziare in alcool etilico 50° 20”

lavare in H2O di fonte 5’

Emallume acido di Mayer, filtrato, 7’

lavare in H2O di fonte 5’

montare in glicerina e lutare

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO AL SUDAN III e SUDAN IV”

Risultati : lipidi neutri da rosso ad arancio; nuclei blu - scuro


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sezioni in H2O distillata

immergere in soluzione contenente Orceina [1 g + 0.4 ml acido nitrico + 100 ml alcool etilico 95 °] 24 h

lavare l’ eccesso di colorante in alcool etilico 85 ° 2’

lavare H2O distillata 10’

colorare con miscela contenente : [0.35 g Blu di alizarina acido + solfato di alluminio 10 g / 100 ml H2O distillata] 10’

lavare H2O distillata 10’

soluzione acquosa di acido fosfomolibdico [5 % ] 20’

lavare H2O distillata 10’

soluzione contenente : [Orange G 2 g + verde luce 0.2 g + CH3COOH 2 ml /100 ml H2O distillata] 10’

lavare H2O di fonte 5’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ORCEINA x FIBRE ELASTICHE”

Risultati : fibre elastiche bruno - rossastro; fibre muscolari e citoplasma violetto; fibre collagene e reticolari verde; eritrociti e mielina arancione; nuclei e strutture basofile blu scuro


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sezioni in H2O distillata

ossidare in permanganato di K ( KMnO4 ) 5’

lavare in H2O di fonte 5’

soluzione di acido ossalico (C2H2O4) 1’

lavare in H2O di fonte 5’

mordenzare in Allume ferrico [2 %] 5’

lavare in H2O di fonte 5’

lavare in H2O distillata

soluzione di Argento nitrato (AgNO3) ammoniacale [10 %] al buio 5 - 8’

lavare in H2O distillata

sviluppare in soluzione di formalina [10 %] 3’

lavare in H2O di fonte 5’

lavare in H2O distillata

differenziare in Cloruro oro (HAuCl4) [1 %] 8 - 10’

lavare in sodio tiosolfato (Na2SO2O3) [5 %] 5’

lavare H2O di fonte 5’

contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’

lavare H2O di fonte 5’

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER IL RETICOLO”

Risultati : fibre reticolari nero; collagene ocra -bruno scuro; nuclei rosso intenso

N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)


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sezioni in H2O distillata

ossidare con soluzione di KMnO4(permanganato di K) 5’

lavare H2O di fonte 5’

soluzione di C2H2O4 (acido ossalico) 1’

lavare H2O di fonte 5’

soluzione di Weigert (resorcina - fucsina) a 60° C 120’

lavare H2O di fonte 10’

Emallume acido di Mayer, filtrato, 3’

lavare H2O di fonte 10’

soluzione satura Li2CO3 15”

lavare H2O di fonte 10’

soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’

lavare H2O di fonte 5’

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “ELASTIC - VAN GIESON”

Risultati : fibre elastiche marrone scuro - nero; collagene rosa - rosso; connettivo giallo; nuclei blu scuro


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MICROSCOPIA ELETTRONICA

  • La M.E. utilizza il potere separatore, a brevissima lunghezza d’ onda, delle radiazioni elettroniche emesse dal cannone elettronico (Filamento di Tungsteno e cilindro di Wehnelt) che consentono di ottenere, in modo appropriato con lenti elettro-magnetiche, ingrandimenti lineari di 30.000 x ed oltre.

  • M.E.T. = Microscopia elettronica a trasmissione; permette di ottenere l’ immagine elettronica, riprodotta su lastra fotografica o su schermo fluorescente, reale ed ingrandita di una sezione di tessuto (spessa da 10 a 100 nm), i cui punti possono essere attraversati o meno da un fascio di elettroni.

  • M.E.S. = Microscopia elettronica a scansione; permette di ottenere un perfetto esame tridimensionale della superficie di un oggetto o un pezzo anatomico o biologico, scandendo il fascio di elettroni la superficie per linee successive, come un pennello elettronico. L’ immagine si ottiene direttamente su tubo a raggi catodici. L’ ingrandimento finale è da 20 a 100.000 x.

  • Dato il potere di penetrazione molto basso degli elettroni, le sezioni devono essere ultra-sottili (60-150 nm), fissate in Tetraossido di Osmio o in Glutaraldeide, incluse in resina e colorate con sali di metalli pesanti(acetato di Uranile e citrato di Piombo), onde aumentare il contrasto dell’ immagine.


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MICROSCOPIA ELETTRONICA

“METODO DI PREPARAZIONE DEI CAMPIONI”

  • fissare un frammento di 1 mm3 in glutaraldeide [2.5 %] in buffer cacodilato o in PBS a 4 °C 2-6 h

  • lavare in PBS (3 cambi) 10’

  • post-fissazione in tetraossido di osmio [1.30 %] a 4 °C 2 h

  • lavare in PBS 20’

  • disidratare i campioni in serie ascendente di alcool 2-3 h

  • chiarificare in toluene o in ossido di propilene 1 h

  • resina epossidica EPON + toluene [1 : 1]RT 12 h

  • resina epossidica EPON RT 12 h

  • inclusione in capsule di gelatina o di plastica e polimerizzazione in stufa a 60 °C 48 h

  • taglio delle sezioni ultra-sottili con ultra-microtomo con lama di cristallo o di diamante

  • le sezioni, di spessore appropriato, vengono raccolte su dei retini di rame circolari e di 3 mm di Ø

  • colorare con acetato di uranile in soluzione acquosa satura 10’

  • lavare in H2O distillata

  • colorare con citrato di piombo 10’

  • lavare in H2O distillata

  • far seguire la disidratazione secondo le tecniche usuali

  • osservare al M.E.

Risultati : doppia colorazione con aumento del contrasto e maggior evidenza di particolari ultrastrutturali;immagini in bianco e nero e\o con tonalità di grigio.


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Citologia

Finalità

Necessità di ottimale fissazione e colorazione delle varie componenti

Modalità di preparazione


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Preparati citologici

  • Striscio - Spatole

  • Citocentrifugati

  • Cervice uterina

  • Urine

  • Versamenti

  • Bronchi

  • Vie bilari

  • Polmone

  • Mammella

  • Tiroide

  • Linfonodi

  • Spazzolati

  • Agoaspirati

  • Microbiopsie


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Citologia

  • Analisi d’immagine

  • Citometria di flusso

  • Automatica

  • Strisci

  • CitocentrifugaFiltri Millipore

  • Centrifugazione liquidi

  • Inclusione di sedimenti

  • Ago

  • Spatole

  • Anse


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Agoaspirati

Sedimenti FissazioneInclusione

Principali Fissativi

Alcool

Formalina

O

H- C

H


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sezioni in H2O distillata

Ematossilina di Harris, filtrata, 3’

lavare H2O di fonte 5’

soluzione alcool - acida a pH 3 (etanolo 70° + HCl) 10”

lavare H2O di fonte 2’

soluzione satura Li2CO3 15”

lavare H2O di fonte 10’

soluzione di etanolo 70° 2’

soluzione di etanolo 95° 2’

Colorare in Orange G 6 3’

etanolo 95° (2 cambi) 20”

Colorare in EA 50 3’

etanolo 95° (2 cambi) 20”

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “PAPANICOLAOU”

Risultati : nucleo blu scuro; citoplasma variante tra il blu-verdastro (basofilia) ed il rosa-arancione\rosso chiaro (eosinofilia)


Col papanicolau vantaggi ed eventi determinanti l.jpg

-Definizione dei dettagli nucleari

-Trasparenza citoplasmatica

-Differenziaione dei vari tipi cellulari

-Corretta fissazione

-Buona col. Nucleare

-Coloranti con sol. altamente alcooliche

-Adeguata diafanizzazione

-Colorazione policromatica

Col. PapanicolauVantaggi ed eventi determinanti


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  • Problemi di colorazione con Papanicolau

  • Coloraz. Nucleare pallida

  • -Insufficente rimozione di

  • “fissativi a pellicola” (polietilen-glicole + alcool etilico)

  • -azione decolorante di HCl

  • -striscio parzialmente asciugato prima della fissazione


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  • Problemi di colorazione con Papanicolau

  • Coloraz. Nucleare pallida (2)

  • -pH dell’acqua corrente

  • poco alcalino

  • -colorante troppo vecchio


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  • Problemi di colorazione con Papanicolau

  • 2)Coloraz. Nucleare troppo intensa

  • -fissazione con alcool >95%

  • -tempo di immersione in HCl

  • troppo breve

  • -striscio troppo spesso

  • che trattiene il colore

  • (N.B. è possibile decolorare)


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  • Problemi di colorazione con Papanicolau

  • 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente

  • -permanenza in alcool 70%

  • troppo lunga = decolorazione

  • -asciugatura dello striscio prima della fissazione = tutto rosa


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  • Problemi di colorazione con Papanicolau

  • 3)Coloraz. Citoplasmatica insoddisfacente

  • -striscio di alterno spessore

  • -tempo di coloraz. scarso o non scuotimento del cestello

  • -scarsa col. con verde luce = sostituire o pH non 4,5-5


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Problemi di colorazione con Papanicolau

4) Riscio di inquinamento e trasporto di cellule

-filtrare i coloranti


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sezioni in H2O distillata

Giemsa puro diluito in H2O al [10 o 20 %] 60’

differenziare in CH3COOH diluito (0.4 ml acido acetico glaciale \ 100 ml H2O) 10”

lavare in H2O distillata

differenziare in etanolo 95°, controllando al microscopio 10”

arrestare la differenziazione con alcool iso-propilico 2’

(3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

effetto Giemsa : produce una particolare colorazione viola -rossastra della cromatina del nucleo a causa dell’ eosinato di Azur.

La soluzione di Giemsapura è formata da eosinato di Azur II, contenente eosinato di Azur B ed eosinato di blu di metilene sciolti anaparti.

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA”

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto

*specialmente elettiva per le cellule del sangue *


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sezioni fatte essiccare all’aria

post-fissazione in metanolo 15’

lavare in H2O di fonte 5’

soluzione di Giemsa puro diluito al [15 %] in buffer fosfato a pH 6.8 (22 ml 0.5 M Na2HPO4 + 32 ml 0.5 M KH2PO4 / 1000 ml H2O distillata) 15’

lavare in H2O distillata

(3 cambi)

fare asciugare a secco

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GIEMSA modificato”

Risultati : DNA e RNA blu; sostanze acidofile rosso - arancio e proteo-glicani rosso - violetto

(eseguito specie su strisci)


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sezioni in H2O distillata

cristalvioletto o violetto di metile [1 %] 1 - 2’

scolare eccesso di colorante

soluzione di Lugol 3 0”

lavare in H2O di fonte

differenziare in soluzione di alcool - acetone 20”

lavare in H2O di fonte

fucsina basica o rosso neutro [1 %] 1 - 2’

lavare in H2O di fonte e tamponare con carta bibula

disidratare in etanolo 100° 1’

(3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione

(Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “GRAM”

Risultati : Batteri Gram + blu scuro; batteri Gram - rosso; colorazione di fondo rosa

N. B. : porre attenzione alla differenziazione


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sezioni in H2O distillata

fucsina basica [10 ml di soluzione al 10 % in etanolo 100 °] in acido fenico [+100 ml fenolo 5 % in H2O distillata e filtrato]; flambare le sezioni sul bunsen sino a farle fumare

lavare in H2O distillata

differenziare in soluzione alcool - acida [HCl 3% in etanolo 70°] finché le sezioni non cedono più colore

lavare in H2O di fonte 10 ’

blu di metilene [1 % in H2O distillata] 5 - 10 ’

lavare in H2O di fonte

disidratare in etanolo 100° sino a che le sezioni non divengono blu pallide 2’

(3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ZIEHL - NEELSEN (KOCH)”

Risultati : Bacilli alcool - acido resistenti rosso; flora batterica e tessuti vari blu

N. B. : porre attenzione alla differenziazione


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INCLUSIONE DELLE CELLULE

Tecnica di allestimento dei preparati citologici in celloidina :

E’ un procedimento atto ad assicurare che tutto il materiale cellulare sia conservato durante i passaggi analitici, raccogliendo le cellule in un film di celloidina così da renderle compatte e non dispersibili.

  • celloidina 10 % : sciogliere 10 g. di celloidina in fiocchi in 50 ml di alcool etilico 99° e poi aggiungere 50 ml di etere (conservare in recipiente di vetro ben sigillato)

  • riempire di celloidina 10 % una provetta in propilene, svuotarla, capovolgerla per allontanarne l’ eccesso onde ottenerne uno strato di 20 - 50 µ. di spessore (cell - bag)

  • riempire la provetta di cloroformio che indurisce la celloidina e svuotarla di quest’ ultimo prima dell’ uso

  • riempire la provetta con la sospensione cellulare, tappare e centrifugare

  • allontanare il surnatante, estrarre delicatamente il cell - bag, ridurne le dimensioni per facilitarne l’ alloggiamento nelle cassettine citologiche ed includere in paraffina.


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sezioni in H2O distillata

Ematossilina di Harris, filtrata, 3’

lavare H2O di fonte 5’

soluzione alcool - acida a pH 3 (alcool 70° + HCl) 10”

lavare H2O di fonte 2’

soluzione satura Li2CO3 15”

lavare H2O di fonte 10’

Eosina [0.25 %], acidificata con qualche goccia di CH3COOH1’

lavare in H2O distillata2’

disidratare in etanolo 95°4’

disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE DI ROUTINE IN CITOLOGIA Ematossilina - Eosina

Risultati:nucleo e batteri gram + blu scuro; citoplasma ed emazie rosa-rosso.


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sezioni in H2O distillata

ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60 - 90 ’

lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’

HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’

sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’

lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’

verde di metile [1 %] 5 - 10 ’

disidratare in etanolo 95° 4 ’

disidratare in etanolo 100° 4 ’

(3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA x I MICETI”

Risultati : miceti in nero; nucleo verde intenso


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sezioni in H2O distillata

soluzione Ammoniaca [2 %] in etanolo 95° overnight

ossidare le sezioni in HIO4 [0.5 % in H2O distillata] 15 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica filtrata e pre-riscaldata : (25 ml H2O distillata + 2 ml di Borace [5 %] + 25 ml soluzione stock : (100 ml di metenammina [3 %] + 5 ml di AgNO3 [5 %]) controllare al microscopio30’ - 40 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

HAuCl4 (cloruro oro) [0.2 %] 2 - 3 ’

lavare in H2O di fonte 5’

sodio tiosolfato [2 %] 2 - 3 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

liquido di Bouin a 60 °C 30’

lavare in H2O di fonte 10’

lavare in H2O distillata 5 ’

soluzione di acido Fosfotungstico [2 %] 1 - 2’

lavare in H2O di fonte 10’

soluzione di cromotropo 2 R : (100 ml. HCl 0.1M + 0.3 g. cromotropo 2 R) 15 ’

lavare in H2O distillata 5 ’

disidratare in etanolo 95° 3 ’

disidratare in etanolo 100° 3 ’

(3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione neutro

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “ARGENTO - METENAMMINA - PAS”

Risultati : miceti in nero; membrane basali in nero; background in rosso


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sezioni in H2O distillata

soluzione di Lugol 5’

decolorare in iposolfito di sodio [5 %] 2’

lavare in H2O di fonte 5’

lavare in H2O distillata

soluzione Dominici (Orange G [1 %] + eritrosina [0.2 %] + 0.05 ml CH3COOH) 10 - 15’

lavare in H2O di fonte 5’

lavare in H2O distillata

soluzione di blu di toluidina [0.5 %] 2 - 3’

lavare in H2O di fonte3’

differenziare in CH3COOH sino a che le sezioni virano al rosa

disidratare in etanolo 95° 4 ’

disidratare in etanolo 100° 4 ’

(3 cambi)

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI MANN - DOMINICI”

Risultati : nuclei blu scuro; eritrociti giallo - arancio; connettivo rosso; granulociti eosinofili rosso; granulociti neutrofili viola; granulociti basofili blu

elettivo per il tessuto emopoietico, i linfomi ed i midolli


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sezioni in H2O distillata

soluzione contenente Orceina acetica [ 2 %] ( 90 ml CH3COOH puro + 2 g orceina + 100 ml H2O distillata 30’

lavare in CH3COOH [45 %] 1’

lavare in alcool butilico terziario 2’

soluzione di xilolo ed alcool butilico terziario 1 : 1 2’

chiarificare in xilolo (3 cambi)

montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

COLORAZIONE IN CITO-GENETICA

“METODO ALL’ ORCEINA ACETICA”

Risultati : i cromosomi si colorano in rosso - porpora

una variante con l’ aggiunta di fast green e ripetuti ed accurati passaggi in alcool a vario grado è utilizzata per identificare la cromatina sessuale che si colora in rosso ed il citoplasma in verde chiaro.


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Microscopia a fluorescenza

Piccole quantità

Illuminazione con luce a  breve

Emissione nel visibile

Fluorescenza

Filtri

Fluoroforo

(Fluorocromo)

Fosforescenza

Eccitazione / Sbarramento

Caratt. Spettro di Assorbimento

Caratt. Spettro di Emissione


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Tipi di Fluorescenza

  • Autofluorescenza

    • O

  • Fluorescenza indotta - Amine biogane + C carboline

    • H

  • N

  • Fluorocromi- effetto “QUENCNING”- vantaggi caratteristici

  • DNA ACRIDINE ORANGE (verde) RNA Rosso

  • METACROMASIA concentrazione polimeri 1 maggiore

  • A.O.CitologiaMETACROMASIA MASCHERATA

  • - fibre elastiche- LIPOFUSCINE

    - NADH2- Porfirine

    - Vit. A

    - Farmaci

    Tetracicline

    Adriamicina

    Chinacrine

    Benzopirene


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    Reagenti di SCHIFFFluorescentiALDEIDI

    FUCSINA BASICA (para-rosanilina)

    Tioflarina T AMILOIDEPROCION yellow cellule

    (neuroni)

    BANDEGGIO CROMOSOMICO COL. SOPRAVITALE cell sorting

    IMMUNOFLUORESCENZALampade

    Problemi di DECADENZAFOTOGRAFIA

    Liq. di montaggio VETRI

    XENON

    MERCURIO


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    Gruppi reattivi dimostrabili su sezioni

    • Importanza in patologia diagnostica

    Acidi Nucleici

    • M.O. Ordinaria

    • M. Fluorescenza

    • (Acridina Orange)

    • Metacromasia

    • Coloraz. con coloranti basici

    • Valutazione Quantitativa (Microspettrofotometria)

    • Controlli con trattamento enzimatico (RNAsi - DNAsi)

    • Reaz. Di FEULGEN


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    Metodi per la dimostrazione

    di acidi nucleici

    • Metodi qualitativi

    • quantitativi

    • Interesse in patologiaVIRUS

    • Distribuzione del DNA

    • Met. Feulgen


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    COLORANTI COMPLESSATI CON METALLI (Lacche)

    • CROMO-GALLOCIANINA

    • Reaz. di FEULGEN

    • per legame purina - Desossiriboso

    • Idrolisi acidaFormaz. di gr. aldeidici

    • Frammentazione del DNA

    • Concentrazione

    • HCl

    • Temperatura

    Sensibilità

    Specificità di

    - reazione

    - localizzazione


    Slide93 l.jpg

    sezioni in H2O distillata

    idrolisi in HCl 1 N a 60 °C per un tempo ottimale in relazione al fissativo usato da 4’ a 25’

    (usare anche HCl 5 N a RT) (10’)

    lavare in HCl 1 N freddo e poi in H2O distillata

    reattivo di Schiff 40’ - 60’

    lavare in metabisolfito di sodio [5 %] 2’

    lavare in H2O di fonte 15’

    contrasto citoplasmatico con verde luce [1 %] 1’

    lavare in H2O di fonte 2’

    disidratare in etanolo 95°4’

    disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “FEULGEN reazione”

    Risultati : il DNA si colora in modo elettivo in rosso magenta; citoplasma verde


    Slide96 l.jpg

    Metodi per la dimostrazione

    di acidi nucleici

    • Metodi qualitativi

    • quantitativi

    • Interesse in patologiaVIRUS

    • Distribuzione del DNA

    • Met. Feulgen


    Slide97 l.jpg

    Luce

    Cell

    Valutazione quantitativa

    Principi

    Variazione di assorbimento

    Lunghezza d’onda


    Slide98 l.jpg

    Laser

    Metodi alternativi

    BRDU

    TIMIDINA TRIZIATA

    - Ibridizzazione in situ

    - Immunocitochimica

    - Autoradiografia

    - Citofluorimetria

    cell sorter


    Slide99 l.jpg

    Autoradiografia

    • Principi

    • Potere di risoluzione

    • Stripping

    • Emulsione

    • Marcatori H3 / P4 / S


    Slide100 l.jpg

    Tempo di Esposizione

    • Principi

    • (Conteggio granuli / fondo)

    • Timidina H3

    • Ibridizzazione in situ

    • Legame di affinità


    Slide101 l.jpg

    Ibridizzazione in situ (ISH)

    • Biotina

    • Digoxiganina

    • Fluorescina

    ICC

    • Dimostrazione di geni su cromosomi (FISH)

    • mRNA specifico - gene espressione

    • (vantaggi rispetto a ICC)

    • RNA / DNA virale

    • Metodi- Sonde

    - S

    - H

    - pH

    Riboprobes

    Oligos

    Marcatura - Raidoatt.

    Auto-radiografia

    Non radioatt.


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    IBRIDIZZAZIONE IN SITU

    I S H

    • Questa tecnica consente di identificare specifiche sequenze di DNA ed RNA e di rivelare in quali cellule tali sequenze sono espresse.

    • La metodica si basa sulla capacità della doppia elica del DNA di dissociarsi (quando riscaldata a 80-100°C, o esposta ad ambiente basico a pH 13)[DENATURAZIONE] per poi ricostituirsi, partendo da due singole eliche complementari [IBRIDIZZAZIONE].

    • Se una delle due emieliche è marcata, si può rendere visibile l’ avvenuta ibridizzazione di doppie eliche neoformate costituite da probe e da acidi nucleici ad esso complementari.

    • La marcatura del DNA avviene chimicamente per inserzione di un gruppo sulfone in 5 sull’ anello della Citosina che reagisce con un AbMc anti-sulfone, e quindi con un 2° Ab coniugato a fosfatasi alcalina (N.B. : inibire la fosfatasi alcalina endogena con esposizione ad 80° C x 5’).

    • Il trattamento con DNasi e\o RNasi elimina la comparsa di positività, mentre quello con solo uno dei due enzimi evidenzia selettivamente un unico tipo di acido nucleico.


    Slide103 l.jpg

    Ibridizzazione in situ (ISH)

    • Sensibilità

    • Localizzazione (Definizione)

    • Conservazione strutturale

    • Problemi

    • Esami genico su singole cellule prelevate da sezioni

    • (necessità di identificazione del tipo di cellule)

    • Sistemi laser / catapulta


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    sezioni in H2O distillata

    trattare in soluzione di Lugol 10’

    lavare in H2O distillata 5 ’

    mettere le sezioni al buio a 60 °C nella soluzione argentica pre-riscaldata (10 ml di metenammina [3 %] + 0.5 ml di AgNO3 [5 %] + 1.2 ml di Borace [5 %]) 60’ - 90 ’ o 18-24 h. al buio RT

    lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’

    HAuCl4 (cloruro oro) [1 %] 2 - 3 ’

    sodio tiosolfato [3 %] 2 - 3 ’

    lavare in H2O di fonte 5 - 10 ’

    contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’

    disidratare in etanolo 95° 4 ’

    disidratare in etanolo 100° 4 ’

    (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI GOMORI PER LA MELANINA”

    Risultati : granuli di melanina nero; cheratina arancio; nuclei rosso intenso


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    sezioni in H2O distillata

    soluzione di Ferrocianuro di K [10 %] 5’

    soluzione di Ferrocianuro K [10 %] + HCl [10 %] (70 ml + 30 ml) 25’

    lavare H2O di fonte 5’

    lavare H2O distillata

    contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’

    lavare H2O di fonte 5’

    disidratare in etanolo 95°4’

    disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PERLS x IL FERRO”

    Risultati : i depositi di ferro si colorano in blu; i nuclei in rosso intenso

    N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)


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    sezioni in H2O distillata

    soluzione di lavoro di Rhodanina [0.3 % in etanolo 100°] (6 ml / 100 ml H2O distillata) a 60° C 120 - 180’

    lavare H2O di fonte 5’

    lavare H2O distillata

    contrasto nucleare con ematossilina Carrazzi 1’

    lavare H2O distillata

    lavare in soluzione di Borace [0.5 %] (tetraborato di sodio) 2’

    lavare H2O distillata

    disidratare in etanolo 95°4’

    disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “PER IL RAME”

    Risultati : depositi di rame color rosa - rosso; nuclei blu scuro


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    sezioni in H2O distillata

    soluzione acquosa di AgNO3 (nitrato Argento) [3 %] 60’

    sviluppare in una soluzione di idrochinone [0.5 %] 3’

    lavare H2O di fonte 5’

    fissare in una soluzione di tiosolfato di sodio [5 %] 3’

    lavare H2O di fonte 5’

    lavare H2O distillata

    contrasto nucleare con NFR (rosso nucleare neutro [1 %] in solfato di alluminio [5 %] a caldo e filtrato] ) 2 - 3 ’

    lavare H2O di fonte 5’

    disidratare in etanolo 95°4’

    disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “METODO DI Von KOSSA x IL CALCIO”

    Risultati : sali di calcio (fosfati e carbonati) nero; nuclei rosso intenso

    N. B. : non utilizzare strumenti metallici (pinzette)


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    sezioni in H2O distillata

    soluzione di lavoro secondo Fouchet : (acido Tricloroacetico (C2HCl3O2) [25 %](50 ml) + Cloruro ferrico (FeCl3) [10 %]( 5 ml) 5 - 10 ’

    lavare H2O distillata

    soluzione di Van Gieson (fucsina acida [1 %] 5 ml + acido picrico 95 ml) 3’

    lavare H2O distillata

    disidratare in etanolo 95°4’

    disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “DI FOUCHET x LA BILE”

    Risultati : biliverdina color verde; collagene rosa - rosso; connettivo giallo


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    sezioni in H2O distillata

    soluzione di Luxol Fast Blue 2 G [0.1 % in alcool isopropilico] 60’

    disidratare in alcool isopropilico assoluto 5’

    (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in mezzo d’inclusione (Entellan o balsamo Canada)

    Tale colorazione, sebbene poco specifica per i fosfolipidi, li colora in modo soddisfacente, specie se disciolti in alcool isopropilico e quindi fornisce ottima colorazione della mielina integra (costituita dalla membrana cellulare della cellula di Schwann).

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA “LUXOL FAST BLUE”

    Risultati : la mielina appare in blu


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    PREPARAZIONE SOLUZIONI

    sol. A : Naftolo AS-D Cloroacetato [10 mg.] + Dimetilformamide [1 ml.]

    sol . B : buffer fosfato0.1 M [30 ml.]

    sol. C : Pararosanilina - HCl : Pararosanilina idrocloride [2 g.] + HCl 2n [50 ml] (sciogliere a caldo, raffreddare e filtrare)

    sol. D : Sodio Nitrato [400 mg.] + H2O distillata [10 ml.]

    sol. E : “working” Pararosanilina - HCl : sol. C [0.4 ml.] + sol. D [0.4 ml.]

    sezioni in H2O distillata

    soluzione substrato : ( 0.8 ml. sol. E + 30 ml. sol. B; sistemare il pH a 6.3 e aggiungere la sol. A; mescolare e f iltrare) 1’ - 2’

    lavare con H2O distillata5’

    Emallume acido di Mayer, filtrato, 5’

    lavare H2O di fonte 10’

    soluzione satura Li2CO3 15”

    lavare H2O di fonte 10’

    disidratare in etanolo 95°4’

    disidratare in etanolo 100°4’ (3 cambi)

    chiarificare in xilolo (3 cambi)

    montare in resina sintetica

    COLORAZIONE IN ISTOLOGIA DIAGNOSTICA ISTOCHIMICA - ENZIMATICA :

    “CLORO - ACETATO ESTERASI”

    Risultati : l’attività enzimatica dell’ esterasi appare in rosa - rosso; i nuclei in blu - scuro


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    SICUREZZA IN LABORATORIO

    • CONSIDERARE OGNI CAMPIONE BIOLOGICO COME POTENZIALMENTE INFETTO

    • SOTTOPORSI ALLE PRINCIPALI VACCINAZIONI

    • USARE CAMICI, GUANTI, CALZARI E MASCHERE PROTETTIVE

    • USARE GUANTI ED OCCHIALI APPOSITI NEL MANEGGIARE AZOTO LIQUIDO

    • USARE GUANTI ANTI-TAGLIO AL MICROTOMO E AL CRIOSTATO

    • USARE CAPPE DI ASPIRAZIONE CON FILTRI SPECIFICI PER FORMALDEIDE E PER XILENE

    • USARE GUANTI E LAME MONOUSO PER DISSEZIONE

    • USARE MASSIMA CAUTELA NELL’ IMPIEGO DI ULTRA-CENTRIFUGHE, FORNO A MICROONDE, AUTOCLAVE, STIRRER ED APPARECCHIATURE ELETTRICHE DA LABORATORIO IN GENERE

    • EVITARE DI CONTAMINARE IL PROPRIO POSTO DI LAVORO E TENERLO IL PIU’ PULITO POSSIBILE

    • CONTROLLARE PERIODICAMENTE IL SISTEMA ANTI-INCENDIO, I SISTEMI DI ALLARME GAS E L’ ACCESSO ALLE VIE DI FUGA

    • OSSERVARE CORRETTA VENTILAZIONE E RICAMBIO ARIA LOCALI

    • NON FUMARE E NON CONSERVARE O CONSUMARE CIBI IN LABORATORIO


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    RISCHI AMBIENTALI IN LABORATORIO

    • RISCHIO BIOLOGICO : TUBERCOLOSI; BATTERI PIOGENI PER AEROSOL; VIRUS EPATITE - HBV - HCV-; HIV (AIDS); INFEZIONI DA LEGIONELLA E DA BLASTOMYCES; DERMATITI.

    • RISCHIO CHIMICO : ESPOSIZIONE A FORMALDEIDE (oltre 1 ppm) e\o GLUTARALDEIDE; ESPOSIZIONE TOSSICA VERSO SOLVENTI ORGANICI (Xilene, Toluene, Benzene, Cloroformio, Alcool....); ESPOSIZIONE VERSO AMINE AROMATICHE(principali coloranti : ponceau,verde luce, fast red, sudan IV, blu toluidina.......); ESPOSIZIONE VERSO LA DAB (benzidina - derivato); ESPOSIZIONE VERSO I METACRILATI (resine per inclusione in M.E., tossiche e corrosive); ESPOSIZIONE ALLERGICA VERSO IL LATTICE.

    • RISCHIO NUCLEARE : ESPOSIZIONE VERSO ISOTOPI RADIOATTIVI USATI NEL MARCARE I PROBES (3H, 14C, 45Ca, 32P, 90Sr, 35S, 131I).

    • RISCHIO FISICO : PUNTURE, TAGLI, LACERAZIONI ED ABRASIONI CUTANEE(nell’ uso del microtomo o nella dissezione in sala anatomica); ESPLOSIONI ED INCENDI ACCIDENTALI (nella preparazione di reattivi o nello stoccaggio degli alcool), ATTI DOLOSI E CADUTE ACCIDENTALI.


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    Definizione

    Difetti o anomalie dei tessuti, da riferire non ad un processo naturale (fisiologico o patologico) ma all’introduzione di materiali estranei, a procedure non corrette di fissazione, inclusione, sezionamento, colorazione, montaggio dei vetrini. E’ importante riconoscere gli artefatti, per evitare di interpretarli (e diagnosticarli) come un processo patologico o una malattia del paziente.


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    1)Artefatti causati prima del prelievo:

    1.1. Polvere di talco

    1.2. Materiale di sutura

    1.3. Effetto da termocauterio

    1.4. Effetto da agenti chimici

    1.5. Particelle di carbone

    6. Garza

    1.7. Essicamento


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    2) Artefatti causati nell’intervallo tra il prelievo ed il trattamento istologico

    2.1. Effetti di schiacciamento

    2.2. Essiccazione

    2.3. Congelamento

    2.4. Chinatura

    2.5. Introduzione di materiali estranei quali grani di polvere


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    3) Artefatti durante la fissazione

    3.1. Autolisi durante la fissazione

    3.2. Fissazione inadeguata o incompleta

    3.3. Effetti da fissazione con Fiss. di Zenker

    (coartazione)

    3.4. Deposito di cristalli di Sublimato mercurico

    3.5. Effetti di estrazione da fissazione in formalina

    3.6. Depositi di Emateina acida da fiss. in formalina


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    4)Artefatti legati a procedure di inclusione

    4.1. Inadeguata fissazione

    4.2. Inadeguata disidratazione

    4.3. Presenza di residui di liquidi chiarificanti

    4.4. Inadeguata infiltrazione di paraffina

    4.5. Uso di paraffina troppo calda


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    5) Artefatti legati alle procedure d’inclusione

    5.1. Inclusione di frammenti multipli di

    diversa durezza

    5.2. Orientamento scorretto dei frammenti

    5.3. Prolungata esposizione a paraffina sciolta


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    6)Artefatti da sezionamento erroneo

    6.1. Angolo di taglio sbagliato

    6.2. Lama o blocchetto mal fissati

    (effetto “tende alla veneziana”)

    6.3. Lame poco affilate

    6.4. Raccolta di frammenti di tessuto anomalo

    “pesci”


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    7) Errori nella raccolta delle sezioni sui vetrini

    7.1. Contaminazione dei vetri da muffe o pollini

    7.2. Uso di quantità eccessive di adesivo

    7.3. Raccolta di frammenti di altri blocchetti

    7.4. Pieghe nelle sezioni

    7.5. Bolle d’aria sotto le sezioni

    7.6. Uso di acqua troppo calda per stendere le sezioni


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    8) Artefatti da colorazione I

    8.1. Mancata sparaffinatura

    8.2. Effetti di bolle tra sezione e vetro

    8.3. Sbagli nella colorazione con:

    8.4. Ematossilina di Harris

    8.5. Emallume di Mayer

    8.6. Eosina

    8.7. Imperfetta disidratazione prima del montaggio


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    8) Artefatti da colorazione II

    Sbagli nelle colorazioni speciali:

    8.5. PAS

    8.6. PAS-diastasi

    8.7. Rosso Congo

    8.8. Giemsa

    8.9. Feulgen

    8.10. Metenamina-argento per i funghi


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    ARTEFATTI ISTOLOGICI

    9) Errori nel montaggio con coprioggetto

    9.1. Contaminazione del liquido di montaggio

    9.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli

    9.3. Erroneo posizionamento del vetrino

    9.4. Intrappolamento di bolle d’aria

    9.5. Montante troppo abbondante

    9.6. Montante troppo scarso


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    ARTEFATTI IN CITOLOGIA

    c.1.) Errori nella raccolta delle cellule

    c.1.1. Cellule sovrapposte

    c.1.2. Cellule troppo rade

    c.1.3. Eccessiva quantità di sangue

    c.1.4. Mancato uso di adesivo

    c.1.5. Effetto da citocentrifuga

    c.1.6. Contaminazione batterica (nelle urine)

    c.1.7. “Stiramento” delle cellule per compressione


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    ARTEFATTI IN CITOLOGIA

    c.2.) Errori nella fissazione delle cellule

    c.2.1. Effetti di essiccamento prima della fissazione

    (nella col. di Papanicolau)

    c.2.2. Effetti di essiccamento troppo lento

    (nella col. di Giemsa)


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    ARTEFATTI IN CITOLOGIA

    c.3) Errori nella colorazione delle cellule

    con la col. di Papanicolau

    c.3.1. Col. Nucleare troppo debole

    c.3.2. Col. Nucleare troppo intensa

    c.3.3. Col. con Orange G troppo debole

    c.3.4. Col. con Orange G troppo intensa

    c.3.5. Col. con Verde luce troppo debole

    c.3.6. Col. con Verde luce troppo intensa


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    ARTEFATTI IN CITOLOGIA

    c.4) Errori nel montaggio con coprioggetto

    c.4.1. Contaminazione del liquido di montaggio

    c.4.2. Uso di coprioggetto troppo piccoli

    c.4.3. Erroneo posizionamento del vetrino

    c.4.4. Intrappolamento di bolle d’aria

    c.4.5. Montante troppo abbondante

    c.4.6. Montante troppo scarso


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