Tema 8. Base molecular de la variaci ón genética

1. Tema 8. Base molecular de la variación genética Mutación y polimorfismo Mutación desde el punto de vista médico genómicas/cromosómicas/génicas Origen y causas de la mutación espontánea/inducida Frecuencia de las mutaciones Variabilidad genética entre individuos Medida de la variabilidad a nivel de proteínas a nivel de DNA Uso de los polimorfismos Aplicaciones forenses de los polimorfismos

2. los seres humanos tenemos una variabilidad fenotípica que podemos observar en muchos rasgos causas genéticas causas ambientales variación en la secuencia de nucleótidos: mutación/polimorfismo

3. Mutación desde el punto de vista médico Genómicas: afectan al genoma completo. Aneuploidías Cromosómicas: afectan a cromosomas particulares. Duplicaciones, deleciones, inversiones, traslocaciones Génicas: afectan a un par de bases Tipos origen frecuencia Genómicas segregación 10-2/división Cromosómicas reordenaciones 10-4/división Génicas espontáneo 1/división (10-9/pb) inducido variable

4. Contribución/origen de la variabilidad genética Hagamos algunos cálculos en términos de nucleótidos un individuo se forma a partir de una célula después de 1015 divisiones totales en un individuo hay miles de mutaciones nuevas. Las consecuencias depende de donde se localizan: DNA codificante/no codificante células somáticas/células germinales 30 mitosis (pubertad) + 23 ciclos/año + 5 (n= años-15) 30+ 23n +5 divisiones 22 mitosis + (pubertad) 2 (meiosis) 24 divisiones Los espermatozoides de un varón de 20 años han sufrido unas 200 divisiones Cada espermatozoide contiene unas 200 mutaciones (sólo como errores de la replicación) En una eyaculación (108 espermatozoides) se generan unas 1010 mutaciones

5. Hagamos algunos cálculos en términos de genes La tasa de mutación es muy variable 10-4 a 10-7/locus/generación Depende de: el tamaño del gen: SST 1480pb a DMD 2x106 pb presencia de “puntos calientes”: GC, la C metilada puede pasar a T Si estimamos una media de mutación 10-6/locus/generación Si estimamos 20.000 el número de genes de nuestro genoma El 2% de los individuos de la población ha recibido un gen con una mutación variabilidad genética

6. La mayor parte de las mutaciones no son deletéreas 1,5% 45% 8,5% 45% altamente repetido moderadamente repetido

7. AAA TTT RNA-binding trascriptasa Tipos de secuencias de DNA DNA de secuencia única: genes (intrones, exones, secuencias reguladoras) DNA moderadamente repetitivo: nº copias 102 – 105 (17%)LINES (elementos largos dispersos): 6-8 kb. L1 sólo 90 activos. (13%)SINES (elementos cortos dispersos): 200-400 pb Alu 106 copias. Constituyen el 10% del genoma MIR y MIR3 (8%)Retrovirus. Retrotrasposones (LTR). HERV son copias parciales. (3%)Transposones de DNA: 3x105 copias DNA altamente repetitivo (DNA satélite): nº copias 106 Minisatélite: 10-100 pb repetidas en tandem (VNTR). Regiones muy variables. Centrómeros y Telómeros. Microsatélite: 2, 3 ó 4 pb repetidas en tandem (STR). Regiones muy variables. En todas partes. Uso en mapeo de genes y perfil genético de un individuo AAA TTT trasposasa

8. Concepto de polimorfismo genético Polimorfismo genético es la presencia de múltiples alelos (variantes) de un locus (al menos dos de ellos con frecuencias superiores al 1%) Locus polimórfico es el que tiene múltiples alelos y para el que al menos el 2% de la población es heterocigótica Medida del grado de polimorfismo Heterocigosis proporción media de genes heterocigóticos en un individuo proporción de individuos heterocigóticos para un gen Heterocigosis media del DNA genómico humano (3x 109 pb) 6% 12-18% 0,37% 1/300 pb es diferente una persona se diferencia de otra en 10 millones de pb variabilidad

9. Detección y medida del polimorfismo a nivel de proteínas las diferentes variantes de una proteina hacen que varíe su mobilidad electroforética

10. Detección y medida del polimorfismo a nivel de proteínas Hay numerosos polimorfismos en los antígenos de los eritrocitos Sistema AB0 (9q34.1-q34.2) Distintos alelos de un gen en el cromosoma 9. A y B son diferentes trasferasas que modifican al antígeno H del eritrocito, 0 codifica una trasferasa inactiva. A AB B plasma (anticuerpo*) anti-B anti-A anti-A y anti-B Grupo sanguíneo A B AB 0 Genotipo AA, A0 BB, B0 AB 00 (* que pueden fabricar) Receptor universal Donador universal Grupos Trasfusiones posibles Trasfusiones posibles como donador como receptor 0 0, A, B, AB 0 A A, AB A, 0 B B, AB B, 0 AB AB AB, A, B, 0 ¿fenotipo Bombay?

11. Detección y medida del polimorfismo a nivel de proteínas Sistema Rh (1p36.2-p34) Se han identificado más de 45 antígenos del sistema Rh, pero de todos ellos cinco son frecuentes: D, C, E, c, e . La herencia de los antígenos Rh es determinada por dos genes RHD codifica la proteína transportadora de antígeno D RHCE codifica la especificidad de la proteína transportadora de los otros Las personas Rh + poseen genes RHD y RHCE. Las Rh - tienen sólo RHCE Rh+ supone la presencia del antígeno D (dominante) y Rh- supone la ausencia. Rh+ es el mas frecuente. Incompatibilidad materno-fetal: enfermedad hemolítica del recién nacido Fenotipo: una destrucción de los eritrocitos fetales ¿Cuando se produce? madre Rh-/ feto Rh+ (primer embarazo). No hay problema. PARTO los eritrocitos de madre e hijo entran en contacto la madre Rh- produce anticuerpos anticuerpos a los varios antígenos Rh madre Rh-/ feto Rh+ (segundo embarazo). Problema: El sistema inmune de la madre considera a los glóbulos rojos factor Rh positivo del bebé como "extraños” y los destruye.

12. Detección y medida del polimorfismo a nivel de DNA Si una persona se diferencia de otra en 1/300, 10 millones de pb nos diferenciamos unos de otros. Esta variabilidad no puede detectarse a nivel de proteías, donde los polimorfismos que se conocen no explican la variabilidad existente en la secuencia de DNA Polimorfismo de longitud de los fragmentos de DNA (RFLP) son variaciones en la secuencia de DNA de un par de bases que afectan a la secuencia de reconocimiento de una enzima de restricción. Se detectan por Southern blot. Bialélico. Polimorfismo del número de repeticiones de secuencias en tandem (VNTR) son variaciones en la secuencia de DNA que afectan al número de repeticiones de una secuencia. Corresponden normalmente a los minisatélites y microsatélites. Se detectan por PCR. Muy polimórfico. Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) son variaciones en la secuencia de DNA de un par de bases. Se detectan con biochips (STR)

13. Southern blot 1. Cortar DNA con ER 2. Separar los fragmentos en una electroforesis 3-4.Transferir los fragmentos a una membrana 5.Hibridar los fragmentos con una sonda marcada 6.Detectar los fragmentos por el marcaje de la sonda + ER RFLP genotipos

14. PCR (polimerase chain reaction) 1.Desnaturalización 2.Reasociación 3.Polimerización x 35 VNTR STR y pb (tamaño) 2000 1400 800 400

15. Biochips Empleo de material biológico sobre un chip DNA chip RNA chip Conjunto de moléculas de DNA inmobilizadas sobre una superficie sólida que nos permite la detección de esas secuencias en las muestras a investigar. SNP (single nucleotide polimorfism) ó snip son polimorfismos de 1 solo nucleótido se calcula que hay 10 millones/genoma 60.000 SNP/DNA codificante 2 SNP/gen

16. ¿cómo funcionan? DNA microarray En cada pocillo se colocan: secuencias de diferentes genes secuencias de diferentes alelos de un gen secuencias de diferentes mutaciones Hibridación con: DNA de diferentes individuos RNA extraído de diferente tipo de células Los SNP permiten la identificación de polimorfismos relacionados con el metabolismo de fármacos (citocromo P450) distintos tipos de cáncer (el oncochip) diagnóstico de enfermedades determinar y cuantificar el nivel de expresión génica

18. Aplicaciones de los polimorfismos http://www.labgenetics.com.es/conocenos.htm Marcadores en el mapeo de genes Diagnóstico presintomático y prenatal de enfermedades hereditarias Detección de heterocigotos de riesgo Pruebas de paternidad Medicina forense

19. Aplicaciones de los polimorfismos a la Medicina forense la información genética de un individuo es única todas las células de un individuo tienen la misma información Identificación de personas con la huella de DNA definida por un conjunto de marcadores genéticos que el individuo heredó de sus padres regiones muy variables (polimorfismos) RFLP poco polimórficos STR decenas VNTR miles

20. Aplicaciones de los polimorfismos en la Medicina forense casos de paternidad B padre C A A madre B D C hijo 1 hijo 2 hijo 3 hijo 4 D ¿? http://www.biologia.arizona.edu/human/problem_sets/DNA_forensics_1/DNA_forensics.html

21. Aplicaciones de los polimorfismos en la Medicina forense identificación de individuos Se analizan diferentes VNTR o STR, lo que da un perfil de bandas para cada individuo Cada alelo tiene una frecuencia La frecuencia del perfil será el producto de dichas frecuencias

22. El sistema CODIS (Combined DNA Index System) El FBI ha sido un líder en el desarrollo de tecnología de tipificación de ADN para su uso en la identificación de autores de delitos violentos. En 1997, el FBI anunció la selección de 13 loci STR que formarían el núcleo central de la base de datos nacional de los EE.UU., llamada CODIS. Todos los STR del CODIS son secuencias repetitivas tetraméricas. Todos los laboratorios forenses o criminalísticos que usan el sistema CODIS pueden contribuir a una base de datos nacional. Los analistas de ADN pueden también buscar coincidencias entre el perfil de ADN de pruebas obtenidas en la escena de un crimen y los perfiles de ADN ya disponibles en la base de datos.

23. Para cada locus genético, se ha determinado su "genotipo" y la frecuencia esperada de su genotipo en cada locus en una muestra representativa de la población. Por ejemplo, en el locus genético conocido como "D3S1358", el genotipo "15; 18". Este genotipo es compartido por cerca de un 8,2% de la población. Combinando la información de frecuencia de los 13 loci del CODIS, se puede calcular que la frecuencia de su perfil sería de uno por cada 7700 billones (7,7x1015) de individuos caucásicos. La Tierra está habitada por 6.700 millones de personas (6,7x 109)

25. U1-U7 son muestras de semen recogidas en 7 casos de violación ¿quién es el violador? el sospechoso S1 el sospechoso S2 el sospechoso S3

27. PCA: probabilidad de coincidencia al azar Ante una prueba de DNA hay tres posibles resultados técnicamente incorrectos: prueba no concluyente patrón de bandas que NO coincide con sospechoso: prueba excluyente el sospechoso queda libre de su sospecha patrón de bandas que SI coincide con sospechoso: prueba concluyente dependiendo de la PCA el sospechoso es declarado culpable dependiendo de la PCA

28. Cálculo de la PCA Cálculos de frecuencia en los perfiles de ADN En una base de datos de referencia establecida a partir de 200 estadounidenses caucásicos, la frecuencia de los alelos 15 y 18 era de 0.2825 y 0.1450, respectivamente. La frecuencia del genotipo (15,18) es, por tanto: P = 2 (0.2825) (0.1450) = 0.0819, u 8.2% Al multiplicar las probabilidades de diferentes genotipos individuales, P=3,6x10-8 Otra forma de expresar esta probabilidad es tomar su inverso, 1 / 3,6x10-8 = 2,78x107 el analista de ADN podría informar de que el perfil de ADN compartido por el sospechoso y la prueba del delito podría darse por azar en una persona de cada 27,8 millones. El jurado podría usar esa información para evaluar si la coincidencia de ADNs puede ser casual.

29. elmundo.es

30. elmundo.es

31. Aplicaciones de los polimorfismos

39. Aplicaciones de los polimorfismos